作为一种拥有多潜能功能的干细胞,神经干细胞(neural stem cells,NSCs),在各个时期的中枢神经系统中,均可以维持自我更新增殖的能力,从而具备干性;在胚胎发育阶段和成年时期的脑中均能启动分化从而形成神经元、星形胶质细胞以及少突胶质细胞等具有不同功能、成熟的神经细胞。目前,NSCs的自我更新、分化命运转变与决定机制是干细胞生物学基础研究中最重要的科学问题。NSCs的自我增殖能力、干性维持能以及向分化命运的启动,是通过对不同时期、阶段特定的转录因子的基因表达进行调控而实现的。因此,如何准确的对调控NSCs自我更新能力、以及对决定分化命运转换分子机制的确定,从而为胚胎期神经系统发育异常以及成体神经系统疾病的预防、治疗提供一定的帮助,这方面的相关研究成为神经干细胞领域中的一个重要的科学问题。NSCs在受到分化信号刺激时可以表达分化命运决定因子MAP2、GFAP和NG2等,从而退出细胞周期失去干性,分化发展成为多种形态、不同功能的成熟的神经细胞。大量研究发现,在细胞生命活动过程中,大部分蛋白质只有经过翻译后的修饰加工才能具有生物活性,从而参与细胞内的各种生命活动。棕榈酰化加工修饰作用,是细胞内蛋白质翻译后最重要的修饰加工方式的一种。目前的研究中,一些关于棕榈酰化的蛋白质组学、关于具有棕榈酰化转移酶功能的DHHC家族的研究结果,暗示细胞内蛋白质翻译后的棕榈酰化修饰加工水平,在各时期神经系统的发育过程中和相关神经系统疾病的发病过程中,可能有着重要的调控作用。因而,明确细胞内蛋白翻译后的棕榈酰化修饰加工,在神经系统发育过程(神经系统发育缺陷)以及成体神经系统疾病发生过程中的作用,及其内在分子水平的调控机制,已经成为近年来神经生物科学相关领域的研究热点。本研究中,我们通过体外培养的小鼠胚胎神经干细胞模型,利用棕榈酰转移酶抑制剂—2-溴棕榈酸(2-bromopalmitate),来探讨细胞内蛋白翻译后的棕榈酰化修饰加工作用在胚胎发育时期神经干细胞中的功能作用及有关的内部分子机制。第一部分2-溴棕榈酸对小鼠胚胎神经干细胞增殖、分化的影响关于棕榈酰化的相关研究中证实,高浓度的2-溴棕榈酸会产生细胞毒性诱导细胞凋亡,而低浓度对细胞活力没有明显的影响,本研究中实验组均采用低浓度的2-溴棕榈酸:10 μM。关于棕榈酰化影响神经干细胞NSCs增殖方面的研究,首先在增殖培养条件下,利用倒置相差显微镜,观察小鼠胚胎神经干细胞的大体形态有无变化,结果显示,2-溴棕榈酸处理组中神经球(神经干细胞自然增殖形成的球状结构)的形态和致密度等,与对照组相比,均没有明显的改变;用MTT实验的方法检测小鼠胚胎神经干细胞的细胞活度,结果显示:增殖培养1天、2天、3天和5天,处理组中神经干细胞的活力,与对照组相比,没有显著的统计学差别;采取神经干细胞NSCs贴壁培养的模式,利用蛋白免疫荧光染色的实验技术,结果发现,2-溴棕榈酸处理组中,神经干细胞的标记物蛋白Nestin,以及干性维持标记物蛋白Sox2的表达,与对照组相比,没有显著的统计学差别;与此同时,利用Western blot的实验技术对小鼠胚胎神经干细胞标记物蛋白Nestin和Sox2的表达量进行检测,结果与免疫荧光实验结果是非常一致的,处理组中Nestin蛋白和Sox2蛋白的表达量与对照组比较,没有明显的统计学差异。以上实验结果表明,2-溴棕榈酸对小鼠胚胎神经干细胞的增殖,没有产生明显的影响。为了探究蛋白质翻译后的棕榈酰化修饰加工作用在神经干细胞NSCs进入分化阶段后的有关影响,首先采用免疫荧光染色技术,以检测与神经干细胞分化成熟为成熟细胞相关的标记物蛋白:MAP2、GFAP和NG2等的表达与分布情况。实验结果显示,2-溴棕榈酸处理组中分化成熟的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞数,与对照组相比,明显减少,并且具有显著的统计学差异。继续利用Western Blot技术,检测神经干细胞分化相关标记物蛋白:MAP2、GFAP和NG2的表达水平,实验结果显示,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组中MAP2、GFAP和NG2等的蛋白水平均呈现出明显的下调。继续利用qRT-PCR技术,检测相关神经干细胞分化命运决定因子水平,来印证2-溴棕榈酸对神经干细胞分化的影响,结果显示,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组中分化命运决定因子NeuroDl、GFAP、0lig2等mRNA的表达受到明显抑制。既然,NSCs的细胞分化是与分化命运决定相关转录因子息息相关,由此可以同时借助多种实验技术对NSCs相关的因子进行检测。通过免疫荧光染色技术,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组中神经干细胞标记物蛋白Nestin和干性维持标记物蛋白Sox2获得持续性的高表达,同时,qRT-PCR结果显示,与增殖相关的多潜能因子Sox2、Nestin mRNA亦获得持续性的高表达。这些结果提示,在分化培养条件下,小分子化合物2-溴棕榈酸,通过抑制与神经干细胞分化命运决定相关因子的表达,促进自我更新增殖相关因子的表达,从而抑制了小鼠胚胎神经干细胞分化命运的发生。第二部分2-溴棕榈酸影响小鼠胚胎神经干细胞分化命运转换的机制研究为了揭示2-溴棕榈酸影响小鼠胚胎神经干细胞分化的内在的分子调节机制,首先利用TUNEL染色技术检测2-溴棕榈酸是否通过促进分化期神经干细胞凋亡而导致分化相关因子的表达减少,结果显示,2-溴棕榈酸处理组中小鼠胚胎神经干细胞凋亡的数量有一定的减少,但是在统计学上没有显著的差异。这表明2-溴棕榈酸对分化期的神经干细胞命运的影响不是由促进凋亡引起的。第一部分中免疫荧光染色技术实验和qRT-PCR技术检测结果显示,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组中神经干细胞干性维持相关因子Nestin和Sox2在蛋白水平和mRNA水平均获得持续性的高表达,说明2-溴棕榈酸是通过促进分化期神经干细胞的增殖,从而抑制其分化的发生。接下来,通过一系列的相关技术实验检测,来再次印证这个结论。首先采用MTT的实验技术检测2-溴棕榈酸对分化时期神经干细胞活力的影响作用,结果显示,2-溴棕榈酸处理组中,MTT值随着分化天数的延长呈现出明显的增长,具有显著的统计学差异。同时利用BrdU掺入法印证分化期神经干细胞命运的改变,结果与MTT实验变化相一致,2-溴棕榈酸处理组中,BrdU阳性的细胞数量明显增加,具有统计学显著差异。以上实验结果证明,2-溴棕榈酸导致小鼠胚胎神经干细胞的分化命运被抑制,增殖能力得到提高。干细胞在接受到分化信号的刺激后,首先得退出细胞周期,然后才能表达分化相关的因子,开始进入细胞分化的状态。既然实验结果显示2-溴棕榈酸抑制了小鼠胚胎神经干细胞的分化,接下来利用细胞流式技术(FACS)检测分化阶段神经干细胞细胞周期的变化。小鼠胚胎神经干细胞分化培养5天,经FACS实验技术检测并分析,结果显示,对照组中的神经干细胞主要分布于G0/G1期(分裂间期);而2-溴棕榈酸处理组中,处于G0/G1期(分裂间期)的神经干细胞数目却显著减少,处于S期(有丝分裂期)的神经干细胞数目明显增多。与此同时,采用qRT-PCR的实验技术,检测与神经干细胞分化相关的多种CKIs(细胞周期依赖激酶抑制因子)表达情况,用来阐明2-溴棕榈酸阻碍神经干细胞细胞周期退出的内在相关分子机制。结果显示,,2-溴棕榈酸处理组中,与分化相关的CKIs因子P21、P27与P57的表达在分化培养24h时即受到明显抑制,而细胞周期增殖标记物Ki67一直维持在高水平表达。以上实验结果表明,2-溴棕榈酸可下调小鼠胚胎神经干细胞分化期相关CKIs家族因子P21、P27与P57等的表达水平,从而使细胞周期的退出受阻,进而抑制神经分化的发生;通过上调增殖相关因子Ki67的表达,从而使处于分化状态下的小鼠胚胎神经干细胞,自我更新增殖能力获得明显提高。第三部分2-溴棕榈酸影响小鼠胚胎神经干细胞分化的表观遗传学研究由第二部分实验得知,在神经干细胞分化过程中,2-溴棕榈酸处理组中分化相关CKIs因子的mRNA表达减少,这表明2-溴棕榈酸是通过在转录水平上抑制分化相关因子的表达,从而抑制神经干细胞的分化并促进其干性维持。在本质上,细胞内基因在转录水平上表达的强弱,与其染色质的开放程度有密切关联,即DNA的双链结构与组蛋白结合的紧密程度有关。因此,首先利用透射电镜(Transmission Electron Microscope,TEM,用于观察细胞内的超微结构),观察细胞核内染色质的形态变化,结果显示,对照组中神经干细胞的核内染色质结构较为松散,为处于转录活跃状态的常染色质形态,而2-溴棕榈酸组中染色质卷曲折叠成致密的团块,为处于转录抑制状态的异染色质形态。利用DNase Ⅰ酶切法检测染色质的开放程度及其与DNA的结合能力,结果发现2-漠棕榈酸处理组中与分化相关的NeuroD1、GFAP与0lg2启动子片段完整性较好,而与增殖相关的Sox2启动子片段与对照组没有显著差异。暗示2-溴棕榈酸抑制分化过程中染色质的重塑过程与分化相关基因(NeuroDl、GFAP与Olg2)的转录激活。目前研究发现,染色质的开放程度与组蛋白的翻译后修饰加工水平有关,主要涉及组蛋白的甲基化和乙酰化程度。利用Western Blot技术对分化期小鼠胚胎神经干细胞内,组蛋白H3的甲基化和乙酰化水平同时进行检测,结果显示,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组神经干细胞中组蛋白H3的甲基化水平,没有出现明显的差异;而对于组蛋白H3的乙酰化水平来说,却出现了显著下降的情形。进一步采用免疫荧光染色的实验技术、染色质免疫共沉淀的实验技术(ChIP,chromatinimmunoprecipitation)等,印证 2-溴棕榈酸对分化阶段神经干细胞内组蛋白H3(具有HAT活性的CBP/P300修饰的下游目标物)乙酰化水平的影响作用。结果发现,2-溴棕榈酸处理组中,组蛋白H3乙酰化阳性的神经干细胞数与组蛋白H3的乙酰化水平明显降低,乙酰化的组蛋白H3与命运决定因子NeuroD1、GFAP、0lig2转录复合物水平亦受到明显抑制,但是Sox2却没有明显变化。已知,P300与CBP是乙酰化转移酶的主要执行者,并且参与调控多种多潜能干细胞的命运决定过程。因此,首先检测2-溴棕榈酸对细胞内CBP/p300蛋白表达量的影响,Western blot结果显示,实验组与对照组没有明显的统计学差异。把细胞裂解后,针对P300与CBP,分别使用P300与CBP乙酰化抗体,利用免疫共沉淀技术,检测其HAT活性,分析发现,与对照组相比,2-溴棕榈酸处理组中P300与CBP的HAT活性均受到显著抑制。这些结果进一步证实2-溴棕榈酸通过下调P300和CBP的乙酰化转移酶活性从而维持小鼠胚胎神经干细胞增殖潜能并抑制其分化进程。第四部分2-溴棕榈酸影响组蛋白乙酰化转移酶CBP/P300活性的分子机制研究2-溴棕榈酸作为棕榈酰转移酶抑制剂,尚未发现其对乙酰化转移酶活性的直接调控作用。因此,首先从棕榈酰化修饰角度研究2-溴棕榈酸对P300和CBP乙酰转移酶活性的调节作用机制。经CSS-Pa14.0软件分析发现,P300和CBP并没有典型的棕榈酰化修饰位点,暗示2-溴棕榈酸可能并不是直接参与调控其功能。据相关研究已知核蛋白EID1,可以与P300/CBP结合并抑制其乙酰转移酶活性,因此,转而检测EID1的相关指标。Western blot结果显示,在2-溴棕榈酸处理组中EID1表达显著上调,并且免疫共沉淀结果亦显示,2-溴棕榈酸组中P300和CBP与EID1的复合物量明显增多。转染EIDlshRNA实验结果挽救了 2-溴棕榈酸介导的神经分化抑制作用,分化相关因子(NeuroDl、GFAP、0lig2)表达增多。这些结果表明,2-溴棕榈酸在神经干细胞命运决定过程中通过上调EID1的蛋白水平从而降低P300和CBP乙酰转移酶活性并抑制细胞分化进程。然而通过RT-PCR进一步分析发现2-溴棕榈酸处理组EID1的mRNA水平没有增加,EID1 mRNA在细胞质、细胞核的分布也无明显差异,暗示2-溴棕榈酸可能是通过维持EID1蛋白稳定从而提高其蛋白水平。为了从棕榈酰化修饰的角度揭示2-溴棕榈酸的作用机制,利用CSS-Pal4.0软件分析EID1的潜在棕榈酰化修饰位点,发现EID1拥有3个较为保守的棕榈酸化修饰位点,分别为氨基酸8、123和152位置,因此,2-溴棕榈酸可能通过调节其棕榈酰化修饰水平从而影响其最终蛋白水平。(1)由于核蛋白EID1第123位的棕榈酰化修饰位点,紧邻其第125位的泛素化修饰位点。因此,猜测可能是由于核蛋白EID1的棕榈酰化修饰影响了其泛素化的修饰水平,从而调控了其蛋白水平的高低。采用免疫共沉淀技术检测EID1的泛素化水平,实验结果发现内源性EID1在神经分化阶段会发生高水平的泛素化,而体外泛素化重构检测发现2-溴棕榈酸虽然改变了 EID1的泛素化水平,却没有明显的影响EID1泛素化的发生。通过Western blot技术检测加入蛋白酶体抑制剂MG132后神经干细胞中EID1的表达量,结果EID1的表达量明显增多,表明EID1的降解是通过蛋白酶体途径实现的。(2)已知,作为脂质化修饰方式之一的棕榈酰化修饰,可以在亚细胞水平(即细胞内各细胞器)调节底物蛋白的分布。利用免疫荧光技术检测2-溴棕榈酸对EID1在细胞内分布的影响,结果发现对照组中EID1主要分布在蛋白酶体,核内很少;而2-溴棕榈酸处理组中,发现在细胞质、细胞核内均有大量的核蛋白EID1的分布。以上结果提示,2-溴棕榈酸抑制了EID1降解的泛素化过程,提高其蛋白水平,并提高了 EID1的核转移分布。2-溴棕榈酸作为已知的蛋白质棕榈酰化抑制剂,有可能是通过抑制核蛋白EID1的棕榈酰化位点,从而影响其蛋白水平和亚细胞分布。接下来通过ABE法检测神经干细胞中核蛋白EID1的棕榈酰化修饰水平,结果发现2-溴棕榈酸导致EID1的棕榈酰化水平显著降低。综和以上实验结果,2-溴棕榈酸通过抑制EID1的棕榈酰化,降低其泛素化水平,减少降解,从而提高EID1的蛋白水平并促进其核转移分布,导致CBP/P300的HAT活性降低,最终抑制了神经分化的发生。结论神经干细胞,作为一种具有多潜能功能的干细胞,其增殖、分化、发育与成熟是现代神经生物学中的研究热点问题之一。作为细胞内蛋白翻译后的脂质化修饰加工方式之一,棕榈酰化,在神经发育过程中的作用及其内在的分子机制尚不清楚。本实验通过建立体外的,小鼠胚胎神经干细胞模型,利用2-溴棕榈酸(一种小分子化合物,作为常用的棕榈酰转移酶抑制剂),来探讨棕榈酰化修饰加工在胚胎早期神经系统发育过程中的作用及其内在的分子机制。经低浓度(10 μM浓度)的2-溴棕榈酸处理后,小鼠胚胎神经干细胞的增殖命运没有发生明显改变。但是,在小鼠胚胎神经干细胞分化阶段,实验结果发现,经2-溴棕榈酸(10μM浓度)处理后,处于分化状态的神经干细胞,因为细胞周期的退出受阻,进而导致神经分化的过程受到抑制,而神经干细胞的增殖情况却保持在一定的高水平状态。进一步的检测结果显示,与分化相关的细胞周期调节因子CKIs家族中P21、P27和P57的表达显著降低。据已知研究结果发现,在神经干细胞的神经分化过程中相关的CKIs家族因子的表达,取决于细胞内组蛋白H3和H4翻译后的乙酰化修饰加工水平。经过一系列关于组蛋白H3的乙酰化检测实验、关于具有乙酰转移酶活性CBP/p300的检测实验、关于可与CBP/p300结合并抑制其乙酰转移酶活性的核蛋白EID1检测实验,结果显示,2-溴棕榈酸可能是通过抑制神经干细胞核蛋白EID1的降解,从而提高其蛋白水平,高水平的EID1通过与CBP/p300结合进而抑制了CBP/p300的乙酰转移酶活性。最终,研究表明,在小鼠胚胎神经干细胞分化阶段,2-溴棕榈酸处理后,由于核蛋白EID1降解的减少,从而抑制细胞内CBP/p300的HAT(乙酰转移酶)活性,降低了组蛋白H3的乙酰化修饰水平,进而导致细胞核内,与分化相关的转录水平降低,CKIs家族因子表达减少,细胞周期的退出受到抑制,致使神经分化命运决定因子的表达减少,而增殖相关命运决定因子表达增多,从而抑制了小鼠胚胎神经干细胞的分化,提高其自我更新能力。这项研究证实了 2-溴棕榈酸(一种小分子化合物)在小鼠胚胎神经干细胞分化命运转换过程中的作用,并深入揭示了其调控CBP/P300乙酰化转移酶活性的分子机制。从组蛋白翻译后修饰加工的角度,认识小分子化合物2-溴棕榈酸对胚胎神经干细胞自我更新及分化命运决定的内在调控机制。建立了多潜能因子、命运决定因子、表观遗传因子及蛋白修饰等在NSCs分化命运转换阶段的相互作用网络。本研究为认识和研究NSCs的命运调控机制的基础研究提供了新的线索,加深了对NSCs发育信号分子调控网络的理解。并使得未来通过使用多种小分子化合物,来改变体内、体外细胞的命运,并且重塑所需细胞的功能成为可能,为多种疾病的治疗提供帮助。创新性:1、本课题首次发现2-溴棕榈酸抑制神经干细胞向神经元和神经胶质分化。2、首次发现2-溴棕榈酸通过抑制EID1的棕榈酰化,降低其泛素化水平并减少蛋白降解,从而提高EID1的蛋白水平并促进其核转移分布,EID1表达升高导致CBP/P300的HAT活性降低,最终抑制了神经干细胞分化的发生。3.首次发现2-溴棕榈酸调控神经干细胞分化的直接作用靶点——EID1,为将来使用小分子化合物重塑细胞功能成为可能。示意图如下:图1:2-溴棕榈酸通过抑制EID1的棕榈酰化,降低其泛素化水平并减少蛋白降解,从而提高EID1的蛋白水平并促进其核转移分布,a.EID1表达升高致使CBP/P300的HAT活性降低,最终抑制了神经干细胞神经分化的发生;b.正常情况下,EID1蛋白若被降解则对CBP/P300的HAT活性无影响,神经干细胞将进行正常分化过程。