容积调控氯通道（VRCC）是氯离子通道大家族中的一员，它表达分布广泛，在细胞维持一定容积与稳态的调控过程中起到了关键作用，并与细胞凋亡等许多生理、病理过程密切相关。关于VRCC的分子基础和激活机制多年来一直未有定论，近年来比较公认的说法是LRRC8（leucine-rich repeat-containing8）是VRCC的分子基础，此外，也有证据表明构成Ca2+激活氯通道（CaCCs）的分子基础 TMEM16（Anoctamins）及bestrophin也可能参与VRCC的构成。　　Ca2+是细胞内重要的第二信使，参与调控许多细胞生理过程。研究发现，细胞肿胀引起的体积变化往往伴随有细胞内Ca2+的升高，越来越多的证据表明，细胞内Ca2+通过微域形式（nanodomain Ca2+）参与VRCC的激活应该是VRCC激活的重要机制之一。　　本课题致力于VRCC的激活机制的研究，第一部分主要探讨 VRCC相关分子LRRC8A和ANO1对VRCC的贡献；第二部分主要探讨细胞内Ca2+在VRCC激活过程中的作用。　　第一部分 LRRC8A及ANO1对VRCC的贡献。　　目的：比较HEK293细胞中LRRC8A和ANO1对VRCC的贡献。　　方法：　　1.HEK293细胞中的VRCC由细胞内高渗溶液或细胞外低渗溶液激活，VRCC电流由全细胞膜片钳技术记录，钳制电压为-60 mV。　　2.利用CRISPR/Cas9技术敲除LRRC8A和ANO1，比较观察分别缺失二者对VRCC电流的影响。　　3.观察过表达LRRC8A和ANO1后对VRCC的影响。　　结果：　　1.在HEK293细胞，容积调控氯通道（VRCC）可被细胞内高渗或细胞外低渗激活，两种激活方式产生的VRCC平均电流密度分别为62.33±3.98 pA/pF（n=22），和59.11±6.20 pA/pF。　　2.敲除LRRC8A后，与野生对照HEK细胞相比，VRCC平均电流密度由62.33±3.98 pA/pF降到3.10±0.68 pA/pF；敲除ANO1后，平均电流密度由62.33±3.98 pA/pF降到49.42±8.36 pA/pF。　　3.在LRRC8A-KO细胞中转染LRRC8A质粒，VRCC平均电流密度恢复至野生对照HEK细胞水平53.34±20.20 pA/pF；转染ANO1质粒，VRCC平均电流密度有所增加，但仍然低于野生对照HEK细胞水平，由ANO1介导的VRCC电流的动力学特征表现与钙激活氯通道（CaCCs）相似。　　结论：　　1.在HEK细胞，细胞内高渗或细胞外低渗激活诱发的VRCC电流大小基本一致，动力学特征一致，都表现为外向整流与正电压下失活的特征。　　2.在HEK细胞，LRRC8A和 ANO1都参与 VRCC的构成，其中LRRC8A贡献较大。　　第二部分细胞内Ca2+参与容积调控氯通道激活的研究　　目的：评价细胞内Ca2+与VRCC激活的关系，比较低渗、血清、ATP引起细胞内 Ca2+升高的变化规律，以及三者诱发的VRCC特征；探索伴随细胞肿胀升高的内Ca2+来源。　　方法：　　1.应用全细胞膜片钳技术记录牵制电压在-60 mV下HEK293细胞的VRCC。观察细胞内分别加入Ca2+螯合剂BAPTA和EGTA后对VRCC电流的影响。　　2.观察细胞外钙对VRCC的影响。　　3.观察细胞外低渗、等渗情况下血清、ATP导致的细胞内Ca2+瞬变。　　4.观察在细胞内外等渗情况下血清和ATP诱发的VRCC电流。　　5.观察Ryanodine受体阻断剂dantrolene和激动剂caffeine对VRCC的影响。　　6.观察利用CRISPR/Cas9敲除磷脂酶PLCγ1和PLCβ4对VRCC电流的影响。　　7.观察细胞外低渗对细胞膜PIP2的影响。　　8.观察细胞膜脂伐调节剂M-βCD对细胞外低渗、等渗血清和ATP诱发的VRCC电流的影响。　　结果：　　1.快速螯合细胞内 Ca2+抑制 VRCC产生。在高渗细胞内液中加入BAPTA和EGTA，前者使VRCC平均电流密度由76.11±4.10 pA/pF（n=12）降至15.72±3.63 pA/pF，而后者对VRCC无影响。在等渗内液中加入BAPTA，并用低渗外液激活VRCC，平均电流密度由56.36±10.94 pA/pF降至2.88±0.51 pA/pF。　　2.细胞外Ca2+对VRCC激活无影响。无Ca2+条件下由细胞内高渗激活的VRCC的平均电流密度为74.28±11.44 pA/pF（n=12），与有外Ca2+情况下的VRCC电流62.33±3.98 pA/pF相比无差别。　　3.低渗细胞外液、等渗血清、ATP都能诱发细胞内Ca2+瞬变，但Ca2+瞬变变化规律不同；敲除LRRC8A不影响内Ca2+浓度；去除细胞外Ca2+对ATP引起的细胞内Ca2+瞬变影响较大。　　4.在细胞内外等渗情况下血清能够诱发一过性VRCC电流，平均电流密度为6.88±1.58 pA/pF（n=12），而ATP不能诱发VRCC。　　5.调节Ryanodine受体功能影响VRCC产生。孵育dantrolene后，VRCC电流密度从71.61±4.89 pA/pF降至25.51±1.97 pA/pF；给予caffeine灌流，记录的11个细胞只有2个产生微弱电流，电流密度分别为4 pA/pF和25 pA/pF。　　6.PLC可能没有直接参与VRCC的激活。敲除PLCγ1和PLCβ4基因后HEK细胞的VRCC平均电流密度分别为67.05±9.53 pA/pF(n=14)和71.61±8.81 pA/pF(n=9)，两者与对照HEK细胞79.95±3.85 pA/pF（n=10）相比较均没有差别。　　7.细胞外低渗条件基本不能诱发细胞膜PIP2水解。　　8.孵育M-βCD对细胞外低渗和等渗血清诱发的VRCC无明显影响。　　结论：　　1.细胞肿胀伴随细胞内钙增加，细胞内钙以微域的形式（nanodomain Ca2+）参与VRCC的激活。VRCC激活时细胞内钙升高是细胞内钙库释放所致，而与细胞外 Ca2+无关；PIP2及 PLC信号通路可能没有直接参与VRCC激活，可能不是细胞微域Ca2+的来源。　　2.与细胞外低渗相似，血清、ATP在等渗条件下都可以诱发细胞内Ca2+瞬变，但血清可以诱发一过性VRCC，而ATP不能诱发VRCC，说明单纯的内 Ca2+升高不能直接激活 VRCC，此外说明体积变化不是 VRCC激活的必要条件。　　3.破坏细胞膜脂筏微域结构并不影响VRCC的激活。