【研究背景与目的】肺癌是全球范围内发病率最高、致死数最多的恶性肿瘤,肺癌的治疗是医学领域所关注的重要内容之一。但长期以来,肺癌治疗药物的总体有效率和患者的生存指标均无明显提高,寻找新的治疗策略成为肺癌研究领域的重要方向。近年来,血管靶向抑制治疗成为新的研究突破口。目前,已有一些血管靶向药物被应用于肺癌的临床治疗,比如人源化抗VEGF-A单克隆抗体贝伐单抗以及小分子VEGFR-2抑制剂索拉非尼和舒尼替尼,但由于这些药物对患者总生存期的改善作用并不明显,且价格偏高,在一定程度上限制了其在临床中的应用。三氧化二砷(arsenic trioxide,As2O3)在我国首先被应用于血液系统肿瘤的治疗,可使急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)患者获得较高的完全缓解率,且无明显的骨髓抑制等副作用,表现出低毒、高效的抗肿瘤作用,被美国FDA批准用于治疗APL。后来研究人员发现,As2O3对包括乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌和基底细胞癌等在内的多种实体瘤亦具有治疗作用,我国药监局已于2004年批准As2O3单药用于治疗晚期肝癌。在肺癌领域,已有研究者就As2O3对肺癌细胞的抑制作用进行探讨,但多数仅限于体外水平的研究。本人所在课题组前期率先将As2O3应用于治疗晚期肺癌患者恶性胸腔积液的临床探索,发现As2O3胸腔内注射能明显减少患者的恶性胸水量,并使胸水颜色逐渐由血性变为淡黄色。这提示As2O3在肺癌治疗中具有潜在的应用价值,但目前尚缺乏全身系统性应用As2O3对肺癌抑制效果的体内实验证据。As2O3对肺癌抑制作用的机制尚不明确,结合在其他肿瘤中的研究结果,可能的作用机制包括:抑制肿瘤新生血管生成、抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞分化和凋亡、降低端粒酶活性等。越来越多的证据表明,As2O3具有抑制新生血管生成的特殊作用,这可能是其抗肿瘤效应的重要原因之一。体外研究发现,As2O3可在基质胶(Matrigel)成管实验中抑制VEGF诱导的内皮细胞形成管腔结构,且抑制效果呈剂量依赖性。体内研究发现,在胃癌皮下移植瘤模型中,以2.5或5.0 mg/kg As2O3腹腔注射处理,可减少移植瘤的肿瘤血管密度及VEGFR表达量,且高剂量组比低剂量组减少更为明显;在纤维肉瘤小鼠模型中,以2.0 mg/kg的As2O3皮下注射,可减低肿瘤内不规则微血管的血流速度,致肿瘤中央血管闭锁,而未发现As2O3对正常组织内的血管有影响。本人所在课题组前期发现,在小鼠肺癌胸膜转移模型中,As2O3通过降低VEGF的水平,减少胸膜毛细血管的通透性,并抑制恶性胸腔积液的形成,提示血管抑制可能是As2O3对肺癌发挥治疗作用的重要环节。目前关于As2O3对肺癌血管调控作用的相关研究很少,As2O3在体内对肺癌血管生成是否具有调控作用仍然是一个未知的问题,As2O3对肿瘤新生血管调控机制的相关实验证据也比较缺乏。本研究首先拟通过体内实验确定As2O3对不同病理类型肺癌移植瘤的生长及肺癌新生血管的抑制作用,以及对移植瘤组织VEGF和Dll4-Notch通路相关因子表达的影响;然后通过一系列体外实验,观察As2O3对肺癌血管新生过程多阶段(内皮细胞增殖、内皮细胞迁移、管腔结构形成)的影响;最后,以内皮细胞为研究对象,研究Dll4-Notch介导As2O3抑制血管管腔形成的作用机制,并检测临床患者肺癌组织中Dll4-Notch通路相关因子的表达情况。希望通过本研究,为As2O3抑制肺癌的作用提供实验证据,对As2O3的肺癌新生血管调控机制做出进一步论证,并探讨As2O3在肺癌治疗中的应用前景。【研究内容与方法】第一部分三氧化二砷对肺癌移植瘤生长及新生血管的抑制作用分别利用人肺腺癌细胞系、人大细胞肺癌细胞系以及人小细胞肺癌细胞系构建肺癌皮下移植瘤裸鼠模型;镜下观察各移植瘤组织是否符合腺癌、大细胞癌和小细胞癌的病理特征。造模成功后用2.5 mg/kg和5.0 mg/kg的As2O3进行干预,以血管靶向抑制剂索拉非尼作为对照药物,以生理盐水作为空白对照,比较各组肿瘤体积和肿瘤生长抑制率;利用CD31荧光抗体对移植瘤组织切片进行染色,比较各组肿瘤组织中新生血管的数量及形态;利用电镜观察As2O3对移植瘤新生血管内皮细胞超微结构的影响。利用免疫荧光、Western Blot和定量PCR等方法,检测各组移植瘤中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1等因子在蛋白水平或m RNA水平的表达情况。为更好地在体内观察新生血管的形态,我们构建了人肺腺癌A549细胞与基质胶(Matrigel)混合移植模型。以不同浓度的As2O3进行干预,通过Masson染色,观察各组移植瘤组织毛细血管内的红细胞数量;利用CD31荧光抗体进行染色,观察比较各组肿瘤组织中新生血管的数量及形态。第二部分三氧化二砷对肺癌新生血管生成过程多阶段的抑制作用:抑制内皮增殖、迁移和管腔形成分别用不同浓度的As2O3处理NSCLC细胞系A549、SCLC细胞系NCI-H446和人脐静脉内皮细胞(HUVECs),以血管抑制剂索拉非尼作为对照药物,以生理盐水作为空白对照。利用CCK-8实验检测各组细胞的增殖情况;通过细胞划痕修复实验检测各组HUVECs的迁移能力;通过Matrigel体外成管实验观察各组HUVECs形成血管网络的能力。利用Western blot和定量PCR,观察血管生成各阶段(内皮迁移、增殖及成管)所涉及的促血管因子及其受体在各组细胞中的表达情况,包括MMP-2、MMP-9、PDGF-BB/PDGFR-β、VEGF-A/VEGFR-2、b FGF/FGFR-1和Dll4/Notch-1。第三部分Dll4-Notch介导三氧化二砷抑制内皮细胞成管的作用机制研究首先,构建Dll4过表达慢病毒和Notch-1干扰慢病毒,并利用这两种慢病毒及相应的阴性对照慢病毒感染HUVECs细胞,再以As2O3进行干预,以生理盐水作为空白对照,观察各组内皮细胞在Matrigel上的管腔形成能力,并检测各组细胞Dll4、Notch-1及其下游靶基因Hes-1的表达水平。最后,利用免疫组化方法检测临床肺癌患者手术标本肿瘤组织与癌旁组织中Dll4-Notch通路和VEGF通路相关因子的表达情况。【研究结果】第一部分三氧化二砷对肺癌移植瘤生长及新生血管的抑制作用1、As2O3能抑制裸鼠肺腺癌、大细胞癌、小细胞癌皮下移植瘤的生长,且呈剂量依赖性。干预结束时,As2O3处理组和索拉非尼组的肿瘤平均体积均小于生理盐水组。肺腺癌模型中,As2O3 2.5 mg/kg组、As2O3 5.0 mg/kg组和索拉非尼组的肿瘤生长抑制率(TGI)分别是28.8%、42.4%和64.9%;肺大细胞癌模型中,3组的TGI分别是71.1%、84.9%和87.2%;肺小细胞癌模型中,3组的TGI分别是27.7%、56.8%和49.1%。2、对移植瘤组织切片用CD31抗体进行免疫荧光染色以显示血管内皮结构,结果显示:三种病理类型的肺癌移植瘤中,As2O3处理组的新生血管密度较对照组明显减少,且血管的管腔结构少于对照组。3、在肺癌细胞和Matrigel混合移植模型中,剥离抑制体观察大体可见,对照组的Matrigel内血管丰富,而随着As2O3剂量增加,Matrigel内血管逐渐匮乏。Masson染色可见位于毛细血管中的红细胞,结果显示:对照组的血液充盈毛细血管最多,随着As2O3剂量的增加,血液充盈毛细血管依次减少。用CD31荧光抗体染色以显示内皮细胞,结果显示:As2O3处理组的新生血管密度较对照组明显减少,且管腔结构较对照组明显异常,管腔呈现扭曲、闭锁的现象。4、电镜下观察肺癌移植瘤组织新生血管内皮超微结构,对照组的血管内皮细胞胞膜光滑完整,细胞核结构清晰,而As2O3处理组的内皮细胞胞膜发生皱缩,核仁在核膜下发生聚集,细胞质内的空泡样变增多。5、定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果提示,As2O3处理组移植瘤组织中VEGF-A、VEGFR-2、HIF-1α、Dll4和Notch-1的表达水平均低于对照组。第二部分三氧化二砷对肺癌新生血管生成过程多阶段的抑制作用:抑制内皮增殖、迁移和管腔形成1、细胞增殖实验结果显示,As2O3处理NSCLC及SCLC细胞,24 h后As2O3处理组与对照组的肺癌细胞增殖情况未见显著差异;处理48 h后,As2O3处理组的肺癌细胞增殖略低于对照组。而另一方面,As2O3对内皮细胞的增殖抑制在24 h时就非常显著,到48 h抑制增殖更加明显,4μM As2O3与血管抑制剂索拉非尼对内皮细胞的增殖抑制作用相当。2、HUVECs细胞划痕实验结果显示,划痕后24 h可以观察到As2O3处理组的划痕修复能力比其他各组减弱。至划痕后48 h,As2O3处理组的细胞迁移距离显著低于生理盐水对照组,As2O3 4μM组比2μM组更加明显,而索拉非尼组的细胞迁移距离却与生理盐水组没有显著差异。3、Matrigel体外成管实验结果显示,As2O3能显著减少HUVECs的细胞连线数量,并能破坏管腔结构形成,使其连线中断、不能形成网络构造;索拉非尼也能减少细胞连线数量,但每个管腔结构依然完整,管腔形态与对照组相似。4、As2O3呈剂量依赖性下调肺癌细胞VEGF-A、b FGF、MMP-2、MMP-9和PDGF-BB的蛋白水平,并呈剂量依赖性下调HUVECs中VEGFR-2、FGFR-1、MMP-2、MMP-9和PDGFR-β的蛋白水平。同时,As2O3能剂量依赖性下调肺癌细胞中VEGF-A的上游因子HIF-1α的m RNA表达水平。As2O3能在蛋白水平抑制肺癌细胞Dll4与HUVECs细胞Notch-1的表达。第三部分Dll4-Notch介导三氧化二砷抑制内皮细胞成管的作用机制研究1、成功构建Dll4过表达慢病毒和Notch-1干扰慢病毒,并用其感染HUVECs细胞。结果显示Dll4过表达慢病毒感染可上调HUVECs的Dll4表达,Notch-1干扰慢病毒感染可下调HUVECs的Notch-1表达。2、Matrigel体外成管实验结果显示:阴性对照慢病毒感染的HUVECs在未加As2O3时能形成交联的血管网络结构,添加As2O3时则不能形成完整的管腔结构;过表达Dll4后,未加As2O3时能形成交联的血管网络结构,添加As2O3时则不能形成完整的管腔结构,仅能形成个别条索状结构;而抑制Notch-1后,在未添加As2O3时则已经不能形成管腔结构,添加As2O3时甚至连个别的条索状结构也不会出现。3、Western blot检测各组HUVECs细胞Dll4-Notch通路及其下游分子在蛋白水平的表达情况,在阴性对照慢病毒感染的HUVECs细胞中,As2O3对Dll4表达的影响不明显,但能够明显抑制Notch-1及其下游靶基因Hes-1的表达;在Dll4过表达的HUVECs细胞中,As2O3依然能够下调Notch-1和Hes-1的表达;在Notch-1 m RNA干扰的HUVECs细胞中,Notch-1和Hes-1表达本身就被下调,As2O3的添加起到叠加作用,使Notch-1和Hes-1的下调程度更大。4、对我们收集的肺癌临床标本进行免疫组化检测,结果显示:Dll4、Notch-1、Hes-1和VEGFR-2在肺癌组织中的表达量均高于癌旁组织。【结论】1、As2O3能通能过抗血管作用从而抑制肺癌移植瘤生长。As2O3不仅可以减少肺癌移植瘤中的新生血管数量,还能阻碍其管腔结构的形成、破坏肺癌新生血管内皮细胞超微结构,这可能与其下调VEGF通路及Dll4-Notch通路的作用有关。2、As2O3能抑制肺癌新生血管生成过程中的多个阶段,包括细胞外基质的降解、内皮细胞迁移、增殖和管腔形成,并抑制上述各阶段所涉及多个促血管因子的表达。3、As2O3通过抑制Notch-1从而阻断Dll4-Notch信号通路及其下游因子,抑制内皮细胞形成血管管腔的能力。4、Dll4-Notch通路相关因子(包括Dll4、Notch-1和Hes-1等)在患者肺癌组织中高表达,提示该通路可能是As2O3在人体内抑制肺癌的作用靶点。