论文部分内容阅读
禽白血病（Avian Leukosis,AL）是一种能够引起宿主产生严重免疫抑制和多种恶性肿瘤的疾病,最早发现于1908年,在我国被列为二类动物疫病。该病病原为禽白血病病毒（Avian Leukosis Virus,ALV）,属于反转录病毒科、正反转录病毒亚科、甲型反转录病毒属、禽α反转录病毒,该病毒既可水平传播又可垂直传播,影响鸡群生产性能,对养禽业危害严重。根据以往的报道,主要将感染鸡群的ALV分为A、B、C、D、E和J共6个亚群,其中J亚群与其他亚群抗原性差异最为显著,感染性和致病力强,系典型的外源性病毒。目前,如何控制ALV-J的流行仍是国际上的研究热点。此外,病毒是如何逃逸宿主的天然免疫系统?如何诱导机体产生免疫抑制并引发多种混合感染?以及病毒如何利用胞内免疫信号通路调控机体抗病毒物质的生成?这些问题仍未得到清晰的阐述。本研究围绕ALV-J对天然免疫信号通路cGAS-STING的抑制效果进行探讨,利用Real-time PCR、双荧光素酶报告系统,定点突变等技术方法,进一步研究ALV-J对宿主天然免疫的影响,旨在揭示ALV-J的致病机制,为疾病的研究提供新的思路。1 ALV-J编码蛋白p15可靶向性抑制cGAS-STING信号通路的活化并促进病毒在DF-1细胞中的复制为了研究ALV-J对宿主天然免疫的影响,本研究检测了 ALV-J感染DF-1细胞中IFN-β mRNA表达水平及病毒增殖情况,并在共转染cGAS和STING的情况下检测感染ALV-J后细胞中IFN-β启动子活性。实验结果显示,病毒在细胞中不断增殖并未能诱导细胞中IFN-β的表达,且能显著抑制cGAS-STING信号通路介导的IFN-β的产生。这表明ALV-J编码蛋白中可能存在拮抗该信号通路的蛋白。利用构建的双萤光素酶报告系统筛选ALV-J编码的10个结构蛋白,并使用通路的特异性激活剂（ISD,2’3’-cGAMP）激活通路,验证病毒编码蛋白抑制效果,同时在鸡巨噬细胞（HD11）中进行重复性验证。实验结果表明,ALV-J编码的p15蛋白可以显著性下调IFN-β启动子活性,使用激活剂活化通路后,在DF-1和HD11细胞中均发现p15显著抑制IFN-β的表达,且具有剂量依赖性。与此同时,p15蛋白对LPS和poly（I:C）刺激下诱导IFN-β的产生也呈现一定程度的抑制效果。此外,本研究还发现p15的过表达对病毒复制呈明显的促进作用。综合以上实验结果,ALV-J的编码蛋白p15可以靶向性抑制cGAS-STING信号通路介导的IFN-β生成,促进病毒的复制,这可能与p15蛋白的生物学功能有关。2 p15蛋白抑制cGAS-STING信号通路作用机制的初步研究ALV-J p15蛋白是一种蛋白酶,为了进一步探究p15的作用机制,本研究首先对ALV-J p15进行生物信息学分析,包括其在多个亚群中的同源性分析,酶活性位点预测等。结果发现,p15基因序列在ALV-A、B、E、J、K等多个常见亚群中氨基酸同源性保持在95%以上,且经过软件预测发现p15蛋白的37D和38S为酶活性位点。利用点突变方法将活性位点进行定点突变（37D→37A,37D38S→37A38A）,构建重组突变质粒,进一步验证突变后对cGAS-STING信号通路的抑制效果是否减弱或消失。结果显示,突变后p15蛋白对IFN-β的抑制效果有所减弱,但并未完全消失,在LPS和poly（I:C）刺激下也出现相同结果。可初步判定该37D和38S氨基酸位点为p15蛋白酶发挥作用的关键位点。为了探索p15蛋白是如何对cGAS-STING信号通路产生抑制作用的?本研究在DF-1细胞中过表达p15蛋白,检测p15对天然cGAS-STING信号通路中关键分子表达是否产生影响。然后分别与各个关键分子共转染,利用Real-time PCR、双荧光素酶报告系统检测p15在信号通路中的作用环节。实验结果显示,p15对天然信号通路中的分子表达没有抑制效果,而共转染实验中发现p15对各个通路分子的基因表达均呈现显著性抑制,故推测p15作用环节在通路下游分子入核机制或核内的基因转录过程。已报道的研究表明,cGAS-STING信号通路下游分子入核过程中扮演主要角色的是IRF-7和NF-κB。实验首先转染天然p15与突变p15表达质粒,加入激活剂激活通路,检测细胞中IRF-7和NF-κB两个分子的基因表达水平变化,随后利用双荧光素酶报告系统检测p15存在条件下两个分子的启动子激活情况。实验结果显示,p15存在下,IRF-7-luc、NF-κB-B1-luc和NF-κB-B2-1uc三个启动子均受到显著抑制;与天然p15相比,突变后p15对于NF-κB的基因表达仍是抑制作用,但对IRF-7基因表达的抑制效果完全消失,这表明p15通过酶活性中心作用于IRF-7。为了检测p15对IRF-7入核的影响,共转染IRF-7与p1 5,进行核质蛋白分离Western Blot实验,检测IRF-7的入核情况。实验结果发现,p15可显著抑制IRF-7的入核。以上结果说明,p15蛋白及其酶活性中心在病毒免疫逃避过程中扮演重要角色,p15其他的生物学作用机制有待进一步研究来阐明。3 ALV-J p15慢病毒表达载体的构建和应用已报道慢病毒作为一种十分强大且灵活的载体工具,可以实现持续的基因传递,目前已在生物学领域广泛应用。因此本研究构建了插入p15片段的骨架质粒,借助慢病毒表达系统介导p15基因在一种或多种细胞中正常表达,并通过共聚焦免疫荧光观察p15蛋白在细胞中的定位情况。实验结果显示,按照比例包装产生的慢病毒具有高效的感染能力,可有效使p15蛋白在293T细胞和LMH细胞中表达,且蛋白定位显示主要在胞浆中表达。以上实验结果表明,本研究成功建立了 ALV-J p15基因的慢病毒表达系统,这一工具将有助于揭示p15蛋白在ALV病毒感染复制,免疫抑制以及相关信号通路中的重要作用及其机制。