研究背景结肠癌是一种常见的消化道肿瘤,在我国发病率逐年上升。近20年来,尽管手术和化疗方式有了很大进步,但患者总体生存率并无显著提高。因此,探索结肠癌发生和发展新机制,寻找新的临床干预思路和策略显得尤为重要。硼替佐米(Bortezomib, PS-341)是全球第一个合成的26S蛋白酶体抑制剂。体外试验证明硼替佐米对多种类型的癌细胞具有细胞毒性。由于临床研究证实硼替佐米对多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤的疗效反应,因此美国食品药品监督管理局通过准许其用于这类病人。目前,在包括结肠癌在内的实体瘤研究正在逐步开展,但临床研究发现单用硼替佐米在实体瘤中的作用有限,可能与化疗抵抗或其他机制有关。因此,硼替佐米的化疗增敏成为目前研究的热点。自噬是一种真核细胞内进化上高度保守的溶酶体依赖性降解途径,其负责胞质细胞器和长寿命蛋白质的降解。近年来研究发现自噬在肿瘤细胞中除了具有抗癌作用,同时还具有促进肿瘤细胞生存的作用,与化疗药物耐药关系密切。AMPK (5’-AMP activated protein kinase,磷酸腺苷活化蛋白激酶)是存在于真核细胞中重要的能量状态感受器和调节器,研究认为活化的AMPK不仅调节细胞的能量代谢平衡,还与细胞凋亡、氧化应激和自噬相关。目前AMPK-自噬与硼替佐米化疗增敏的关系及其具体调控机制尚无研究报道。前期研究结果证实,硼替佐米能显著抑制结肠癌细胞的存活,并诱导癌细胞凋亡。本研究将以mPTP (mitochondrial permeablity transition pore,线粒体膜通透性转换孔)-Cyto-C (cyto-chrome C,细胞色素C)通路为着眼点,研究硼替佐米抗结肠癌细胞的分子机制；并进一步以AMPK-自噬信号通路为靶点,研究结肠癌细胞株对硼替佐米耐药的可能分子机制,寻找可能的逆转靶点,以增加硼替佐米的疗效。本研究共分三个部分：第一部分研究硼替佐米抗结肠癌作用及其分子机制；第二部分研究硼替佐米诱导结肠癌细胞保护性自噬；第三部分研究硼替佐米通过介导TAKl (TGF-β-activated kinase 1,转化生长因子激酶1)-AMPK通路诱导结肠癌细胞保护性自噬。第一部分 硼替佐米抗结肠癌作用及其分子机制的研究目的观察硼替佐米抗结肠癌的作用,解析其可能分子机制。方法以结肠癌细胞株HT-29、HCT-116以及SW-620为研究对象,采用MTT法观察硼替佐米对结肠癌细胞增殖的影响,采用台盼蓝排斥法观察硼替佐米对结肠癌细胞死亡的影响。以结肠癌细胞株HT-29为研究对象,采用流式细胞仪观察硼替佐米对结肠癌细胞凋亡及细胞周期的影响,JC-10荧光定量法检测硼替佐米对结肠癌细胞MMP的影响,Western Blot法检测硼替佐米对结肠癌细胞Cyto-C蛋白表达水平的影响。进一步以硼替佐米处理的HT-29为研究对象,加入mPTP抑制剂SFA和CSA, MTT法观察处理前后对结肠癌细胞增殖的影响,JC-10荧光定量法检测处理前后对结肠癌细胞MMP的影响,Western Blot法检测处理前后对结肠癌细胞Cyto-C蛋白表达水平的影响。结果与对照组相比,硼替佐米组结肠癌细胞株]HT-29、HCT-116以及SW-620存活率下降、死亡率上升,差异有统计学意义(p<0.05)。与对照组相比,硼替佐米组结肠癌细胞株HT-29细胞凋亡上升、细胞周期G1期阻滞、MMP下降、Cyto-C蛋白表达水平上升。与单硼替佐米组相比,加入SFA或CSA的硼替佐米组细胞存活率上升、MMP上升、Cyto-C蛋白表达水平下降。结论硼替佐米抑制结肠癌细胞增殖、促进死亡、诱导凋亡和细胞周期G1期阻滞；诱导MMP下降、nPTP开放及细胞色素C释放可能是硼替佐米抗结肠癌活性的核心分子事件。因此,以硼替佐米为代表的蛋白酶体抑制剂有望作为新型的抗结肠癌药物。第二部分 硼替佐米诱导结肠癌细胞保护性自噬目的明确硼替佐米诱导结肠癌细胞自噬与化疗抵抗的关系。方法以结肠癌细胞株HT-29为研究对象,加入硼替佐米(100nmol/L,12或24小时),荧光显微镜下采用GFP-LC3B融合蛋白来示踪硼替佐米对细胞自噬形成的影响,采用Western Blot法检测硼替佐米对细胞LC3B-I、LC3B-Ⅱ、自噬相关蛋白Beclin-1及p62的蛋白表达水平、Ulk1磷酸化水平的影响；以硼替佐米处理后的结肠癌细胞HT-29为研究对象,加入自噬抑制剂3-MA(1 mmol/L)或氯喹(400 μmol/L),流式细胞仪观察细胞凋亡的变化,MTT法检测细胞增殖的变化。结果与对照组相比,硼替佐米处理组GFP-LC3B融合蛋白细胞比例明显增多,LC3B-Ⅰ蛋白表达下降,LC3B-Ⅱ蛋白表达上升,Beclin-1蛋白表达水平上升,p62蛋白表达水平下降,Ulk1磷酸化水平上升。与单硼替佐米组相比,加入3-MA或氯喹的硼替佐米组细胞凋亡增加、存活率下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论硼替佐米同时诱导结肠癌细胞凋亡和自噬。硼替佐米诱导的结肠癌细胞自噬促进肿瘤细胞存活,是结肠癌细胞对硼替佐米耐药的可能机制。第三部分 硼替佐米通过介导TAK1-AMPK通路诱导结肠癌细胞保护性自噬目的解析TAK1-AMPK-自噬信号通路在结肠癌对硼替佐米耐药中的作用。方法以结肠癌细胞HT-29为研究对象,采用Western Blot法检测硼替佐米对细胞株AMPKa及ACC总蛋白和磷酸化水平的影响。以硼替佐米处理后的结肠癌细胞HT-29为研究对象,采用慢病毒shRNA敲减AMPKa或加入AMPK抑制剂Compund C,荧光显微镜下采用GFP-LC3B融合蛋白来示踪处理后细胞自噬形成并进行计数,Western Blot法检测LC3B-Ⅱ蛋白表达和Ulk1磷酸化水平的变化,流式细胞仪检测凋亡的变化,MTT法检测细胞增殖的变化。采用慢病毒shRNA敲减TAK1,Western Blot法检测AMPKa磷酸化、Beclin-1和p62蛋白表达水平变化,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化,MTT法检测细胞增殖的变化。结果与对照组相比,硼替佐米处理组AMPKα、 ACC和TAK1的磷酸化表达水平明显上升。与对照组相比,敲减AMPKα或加入Compund C组GFP-LC3B融合蛋白细胞比例显著下降、凋亡增加、存活率下降,差异有统计学意义(p<0.05),敲减AMPKa组总AMPK、ACC、LC3B-Ⅱ蛋白表达水平及AMPK、ACC、Ulk1磷酸化水平均显著下降。与对照组相比,敲减TAKl组AMPKa磷酸化水平及Beclin-1蛋白表达水平下降,p62蛋白表达水平上升。同时,细胞凋亡增加、存活率下降,差异有统计学意义(p<0.05)。结论AMPK-自噬通路是结肠癌细胞对硼替佐米耐药的可能机制,抑制／敲减AMPK可以增加结肠癌细胞对硼替佐米的敏感性。TAK1可能是结肠癌细胞中硼替佐米激活AMPK-自噬的上游激酶,具体的调控方式还有待于进一步研究。