背景与目的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)来源于中胚层,主要存在于全身的结缔组织与器官间质中,以骨髓中的含量最多。骨髓间充质干细胞具有自我更新的能力与多向分化、增殖的潜能。骨髓间充质干细胞因为具有可于自体获得、易培养、移植后能够长期存活并且不会出现排斥反应,可被外源基因转染并长期表达的优点,近年来成为组织工程、细胞治疗、基因治疗及器官移植的研究热点,在多学科多领域做为一种理想的种子细胞得到了广泛应用。但是骨髓间充质干细胞虽然在体内的来源比较广泛,但是数量极少,并且随着身体机能的下降与个体的衰老,数量会逐渐减少。而组织工程与细胞工程开展的首要条件是种子细胞的获取和培养传代,如何能够在体外获得足够数量和较高纯度的种子细胞极其重要。而且目前尚没有对骨髓间充质干细胞进行直接鉴定的方法。通过本研究拟建立一种体外分离培养、扩增骨髓间充质干细胞的理想方法,并且观察其生长特性,探讨其鉴定方法,为其在组织工程学与细胞工程学等学科的应用奠定基础。材料与方法选用健康中国青山羊,骨髓穿刺法抽取髂骨骨髓,应用密度梯度离心法从中分离出骨髓间充质干细胞,结合贴壁筛选法进行培养,显微镜下观察细胞形态与生长情况,测定细胞成活率及传代细胞贴壁率,对第2、4、6代细胞采用连续计数法绘制出生长曲线,计算细胞倍增时间,免疫细胞化学染色法鉴定细胞表面抗原标志。结果1.骨髓间充质干细胞原代细胞培养的形态观察：培养后24h可见部分细胞贴壁,贴壁细胞多呈椭圆形。48 h后可见更多的细胞贴壁,贴壁细胞有伸展变形现象,细胞伸出伪足,形态渐变为梭形、多角形。4～6d后可见数个细胞集落形成,显微镜下见贴壁细胞的细胞膜及细胞核清晰。随培养进行细胞集落进一步增多,细胞生长逐渐融成片状,12～14d时可长满培养瓶底80%。2.骨髓间充质干细胞传代细胞培养的形态：细胞传代后6～8d即可长满瓶底,细胞融合率可达100%。传代细胞镜下呈均一长梭形,细胞膜及细胞核清晰,细胞密度较高时呈放射状、漩涡状排列。3.骨髓间充质干细胞的鉴定结果：第3代骨髓间充质干细胞免疫组化染色,细胞表面抗原CD29,CD44呈阳性表达(胞浆呈黄褐色染色),CD34,CD45呈阴性表达。4.骨髓间充质干细胞的生长曲线与倍增时间：生长曲线呈S型,1-3d为潜伏期,生长速度较为缓慢；2-3d后进入对数增长期,生长速度明显加快；6-7d后进入平台期,生长速度趋于稳定。第2、4、6代细胞平均倍增时间分别为(25.37±1.04)h,(27.45±0.91)h,(29.49±2.02)h,总体平均倍增时间为(27.44±2.18)h。结论1.本研究采用密度梯度离心法从山羊骨髓中分离骨髓间充质干细胞,结合贴壁培养法进行体外培养扩增,细胞生长状态良好,体外增殖能力较强。2.通过鉴定细胞表面抗原标志,结合形态学观察,证实研究中所分离培养细胞是骨髓间充质干细胞。