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新孢子虫病是由犬新孢子虫(Neospora caninum)寄生于牛、羊、犬等多种动物细胞内引起的一种原虫病。新孢子虫病可以引起新生儿的运动障碍和神经系统疾病以及孕畜流产、死胎,尤其是奶牛的流产,给畜牧业带来了巨大的经济损失。新孢子虫病的早期准确诊断是有效的控制该病的发生和蔓延的重要手段。因此,本试验拟采用新孢子虫表面蛋白NcSRS2建立间接ELISA诊断方法,用于牛新孢子虫病诊断。本试验根据GenBankTM上发表的新孢子虫NcSRS2序列,设计合成一对引物,以新孢子虫总核酸为模板,PCR方法扩增NcSRS2基因,与pMD18-T载体连接并转化到JM109宿主菌中,获得阳性重组质粒pMD18-T-NcSRS2。将重组质粒pMD18-T-NcSRS2进行亚克隆,祛除信号肽和疏水端得到阳性质粒pMD18-T-NcSRS2t。阳性质粒pMD18-T-NcSRS2t和表达载体pET-28a(+),经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收,连接,转化到JM109宿主菌,提取质粒,酶切鉴定正确后,阳性质粒转化到最佳宿主菌BL21(DE3)中,构建含有NcSRS2t基因表达载体的重组菌株BL21(pET-28a-NcSRS2t)。经酶切鉴定和DNA序列分析证实,构建的重组质粒pET-28a-NcSRS2t中含有NcSRS2t基因,且基因序列和阅读框架均正确。将重组菌株BL21(pET-28a-NcSRS2t)按1%的量接种到含有Kan(50μg/mL)的LB液体培养基中,37℃振荡培养2.5h,然后用1mmol/L IPTG诱导4h,融合蛋白NcSRS2t获得高效表达。经Western blot检测,重组菌株表达的融合蛋白能够被新孢子虫特异性抗体所识别。以纯化的重组蛋白NcSRS2t作为抗原包被酶标板,通过对间接ELISA各反应条件的优化,确定了最佳反应条件为:抗原的最佳包被液为50mM pH9.6的碳酸盐缓冲液;抗原最佳包被浓度为5.0μg/mL;最佳封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃1h;最佳血清稀释液为5%脱脂奶粉,血清稀释倍数为100倍;HRP-兔抗牛IgG的最适工作浓度为1:5 000。采用已确立的间接ELISA反应条件,对218份阴性血清的检测结果进行统计学分析,确定了间接ELISA方法判定标准,即OD450值大于等于0.32为阳性,小于0.32为阴性。应用建立的间接ELISA方法对128份阴性血清和50份阳性血清(经IDEXX公司新孢子虫抗体检测试剂盒证实)的检测结果表明,ELISA方法的特异性为93.0%,敏感性为90.0%。采用本试验建立的新孢子虫病间接ELISA诊断方法对黑龙江省的克山、海林、双城、甘南、克东、富裕、牡丹江、大庆等8个县(市)奶牛场的540份奶牛血清进行了检测。结果表明,黑龙江省部分地区奶牛新孢子虫的抗体阳性率为13.33 %,各县(市)奶牛血清抗体阳性率在5.56～23.81 %之间;流产奶牛血清抗体阳性率为14.88%,未流产奶牛为10.26%,其中血清抗体阳性奶牛主要在妊娠中晚期流产;不同年龄段、不同妊娠胎次奶牛血清的抗体阳性率差异均不显著(P > 0.05),不同品种、不同饲养方式奶牛血清抗体阳性率差异均显著(P﹤0.05)。本试验间接ELISA诊断方法的建立及初步应用为新孢子虫病诊断试剂盒的研制和新孢子虫病的预防奠定了基础。