生命有机体的新陈代谢过程不断产生各种活性自由基,包括过氧化氢(H202)、单线态氧(1O2)、超氧阴离子(O2·-)、羟基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)、过氧亚硝酸根离子(ONOO")等。低浓度的自由基对生命体的正常生理过程和病理状态都有着重要的调节作用,而高浓度的自由基会对生命体产生氧化损伤。为了深入研究自由基在生命体中的功能需要快速、灵敏、准确并适用于复杂生物体系的分析方法。有机小分子荧光探针能快速捕获自由基,以此为基础的荧光分析法可实现对自由基的高灵敏度、高选择性的实时检测。本论文对H2O2、1O2、O2·-、·OH、NO、ONOO的有机小分子荧光探针的研究进展进行了总结与评述。在此基础上,以NO自由基为研究对象,以红移荧光波长至近红外光区(Near-infrared, NIR,>600nm)并提高探针及其NO衍生产物的细胞保留能力为目的,设计合成了两种新型NIR邻苯二胺二氟化硼二吡咯甲烷(BODIPY)类NO荧光探针,4,5-二氢-8-苯基-(3,4-二氨基)-二氟化硼二苯并[g]吲哚甲烷(DANPBO-H)和3-甲基-4,5-二氢-8-苯基-(3,4-二氨基)-二氟化硼二苯并[g]吲哚甲烷(DANPBO-M)。利用NIR DANPBOs (DANPBO-H, DANPBO-M)与高效液相色谱分离荧光检测(HPLC-FD)、荧光显微镜和荧光分光光度计相结合,建立了多种背景干扰小、灵敏度高、选择性好、简单、快速的NO分析新方法,将所建立的方法用于检测细胞、动物组织、全血和植物组织中的NO,并对不同环境下其中NO的微小变化进行了研究。具体研究工作主要分为以下几个方面：(1)将1,2,3,4-四氢化萘引入BODIPY的母体结构,设计合成了两种新型的NIR BODIPY类NO荧光探针,4,5-二氢-8-苯基-(3,4-二氨基)-二氟化硼二苯并[g]吲哚甲烷(DANPBO-H)和3-甲基-4,5-二氢-8-苯基-(3,4-二氨基)-二氟化硼二苯并[g]吲哚甲烷(DANPBO-M),并对其结构进行了表征。详细研究了这两种探针及其NO衍生产物DANPBO-H-T和DANPBO-M-T的荧光性质,初步考察了DANPBOs (DANPBO-H,DANPBO-M)和DANPBO-Ts (DANPBO-H-T, DANPBO-M-T)的细胞保留能力。DANPBO-H和DANPBO-M的量子产率分别为0.0004和0.001,与NO反应后荧光量子产率分别增加了400倍和550倍。DANPBO-H-T和DANPBO-M-T的最大激发/发射波长分别为621/631nm和609/619nm。DANPBO-Ts经氙灯照射24h后,荧光强度几乎没有变化,表现出良好的光稳定性；其荧光受溶剂和pH影响小；初步研究发现DANPBOs和DANPBO-Ts可在细胞内保留3.5h而无泄漏。(2)利用DANPBO-H及其衍生产物的波长在NIR区可减少来自生物分子自身荧光干扰的特点,将DANPBO-H作为柱前衍生试剂,建立了HPLC-FD法检测多种生物样品中NO的新方法。衍生反应于35℃下20min完成,衍生产物以甲醇/四氢呋喃/50mM pH7.0H3Cit-NaOH缓冲溶液(81/7/12,v/v/v)为流动棚等度洗脱3.5min内出峰。该方法的线性范围为6.0×10-9-2.00×10-7M,检测限为5.5×10-10M(S/N=3)。比较了相同流动相条件下检测波长分别为621/631nm和496/505nm时,水稻、小鼠各组织和细胞样品基质的出峰情况。所试验的生物基质在检测波长为621/63l nm时几乎没有信号峰的出现,且基线光滑平坦；而在检测波长为496/505nm时有较多杂峰,且基线噪音也较大。将建立的方法用于水稻、小鼠各组织和细胞样品中NO分析,回收率为95.108%,相对标准偏差(RSDs)小于2.3%。与现有的HPLC-FD检测NO的方法相比,该方法样品前处理和色谱分离简单、基线噪音低、生物基质不干扰衍生产物分离。(3)根据DANPBOs及其NO衍生产物细胞保留力好的优点,将其用于人脐静脉内皮细胞(ECV-304)和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)中NO的活体成像。实验表明,DANPBOs及其溶剂丙酮在选定的实验条件下几乎没有细胞毒性；DANPBOs在对细胞中的NO成像时,完全避免了来自细胞内基质自身荧光的干扰,且3.5小时内探针及其衍生产物无泄漏,有效克服了由泄漏引起的细胞外背景荧光增强,证实了我们关于脂溶性分子同样具有良好细胞保留能力的判断,打破了为提高荧光探针及其衍生产物在细胞内的保留能力必须引入多个酯基的限制。在此基础上,将DANPBO-H用于RAW264.7释放的NO荧光成像,其成像条件为：2.5μg/mL LPS刺激16h,3.0×10-6M DANPBO-H孵育35min。该方法不仅提高了荧光成像的灵敏度和质量,还适于细胞活动的过程监控和长时间跟踪。(4)基于NIR荧光探针DANPBOs在组织成像时散射光和生物背景干扰低、组织穿透能力强、生物光损伤小的优辨,建立了荧光成像法检测动物组织中NO的新方法。DANPBOs可高灵敏地捕获肝损伤小鼠肝脏所释放的NO,并发出明亮的红色荧光,而正常小鼠肝脏没有荧光生成。结果表明,DANPBOs在活体成像方面具有明显的应用潜力,该方法还为研究疾病与NO的关系提供了一种有效的可视化手段。(5)将DANPBO-H与荧光体式显微镜结合,建立了水稻根中NO的荧光成像分析方法。首先,将该方法用于水稻根中内源性NO的荧光成像,表明水稻根中的荧光产生是由内源性NO所引起的,同时还证实了水稻根中产生NO的一氧化氮合酶途径和硝酸、亚硝酸还原酶途径。考察了水稻根在盐、干旱和高低温的非生物胁迫条件下,产生NO量的变化情况。发现除了高温胁迫外,其他的胁迫均使水稻根的NO增加。该方法能快速、简便、直观、无损地检测植物组织中的NO,可用来研究植物内NO的来源和监测植物在不同条件下NO的产生及其含量的微小变化。(6)利用建立的DANPBO-H结合荧光体式显微镜成像方法考察了植物激素α-萘乙酸、吲哚乙酸,吲哚丁酸、赤霉素、脱落酸、水杨酸对水稻根产生NO的影响。研究表明,经植物激素处理后,水稻根产生的NO量有明显变化,而我们建立的基于DANPBO-H的荧光组织成像法可快速、实时、灵敏、直观地反映这种变化,是研究植物激素与NO关系和NO作用机制的强有力工具。(7)由于DANPBO-H用于荧光光度法检测NO可有效降低散射光和生物背景干扰,以DANPBO-H衍生NO,建立了一种方便、快速、直接、灵敏、抗干扰能力强的荧光光度法测定生物样品中NO的新方法。该方法的线性范围为4.0×10-8-5.0x10-7M,检测限为2.3×10-9M(S/N=3)。将该方法用于栀子花、洋葱和绿豆芽中NO的直接测定,回收率在95.65-104.76%之间,相对标准偏差(RSDs)小于2.21%。该方法可用于许多生物样品中NO的直接测定,在常规、大批量样品的分析和监控中具有重要的价值。