研究背景肠杆菌科细菌是院内感染和社区获得性感染的重要病原菌。近年来由于头孢菌素的广泛应用,肠杆菌科中产超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamases,ESBLs)及AmpC酶的菌株比例呈明显上升趋势,治疗此类菌株感染的首选药物是碳青霉烯类抗菌药物。但是,伴随着亚胺培南和美罗培南在临床上的大量使用,耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(carbapenem-resistanct enterobacteriaceae,CRE)数量也呈逐年上升趋势。临床研究表明CRE菌株对多种抗菌药物耐药,因此临床治疗药物的可选择范围明显受到限制。此外,感染患者往往伴有并发疾病,给临床感染控制和治疗带来极大困难。研究表明,CRE的主要耐药机制是产碳青霉烯酶,目前已证实肠杆菌科中的产酶类型主要是Ambler A类的KPC型,B类的VIM型、IMP型、NDM-1型及D类的OXA-48型,其中以KPC型最多,目前已在美国、法国、意大利、印度及中国等世界多个国家和地区出现,而其他产酶类型的相关报道则较少。B类的碳青霉烯酶又称金属β-内酰胺酶(metallo-beta-lactamases,MBLs),简称金属酶,是一类活性位点含有金属离子的β-内酰胺酶,这些酶能够有效水解除单环类抗菌药物以外的几乎所有β-内酰胺类抗菌药物。IMP型碳青霉烯酶是MBLs中的一种常见产酶类型,其耐药基因由染色体或质粒介导,已经在铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等非发酵菌中广泛传播。而近年来,在肠杆菌科中也发现了产IMP型MBLs的菌株,引起了临床的广泛关注。关于碳青霉烯酶的检测,分子生物学技术一直是检测产酶类型的金标准,但该方法操作繁琐、耗时长且对仪器要求较高,不利于产酶菌株的快速鉴定。相对简单的表型检测技术更有助于早期发现菌株的产酶信息,及时地对感染菌株进行控制。CLSI(Clinical&Laboratory Standards Institute)标准推荐改良 Hodge 试验(modify Hodge test,MHT)检测碳青霉烯酶的表型,但标准中仅提及用于KPC型酶的检测,对其他酶型的检测尚无充分依据。此外,关于CRE的抗菌治疗主要集中于以KPC型为主的感染菌株,对产IMP型酶CRE感染治疗的大样本研究尚未见报道。本研究收集聊城地区三家综合性医院近七年间检出的CRE菌株,对其耐药性、表型检测、基因型、同源性及临床感染特征进行研究,以期为临床抗感染治疗和防止耐药菌株的进一步播散提供理论依据。第一部分耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌的分布特点及耐药性分析目的:研究聊城地区CRE菌株的菌种分布特点及耐药趋势,分析总体耐药情况及不同CRE菌种之间的耐药性差异。方法:研究菌株来源于聊城市三家综合性医院(聊城市人民医院,聊城市中医医院,聊城市第三人民医院)自2010年1月至2016年12月间临床非重复分离的肠杆菌科细菌。应用Vitek MS全自动快速微生物质谱检测系统对细菌菌种进行鉴定,利用Vitek 2 compact全自动细菌鉴定药敏系统对菌株进行药敏实验,筛选出对碳青霉烯类抗菌药物敏感性下降(中介或耐药)的菌株。对CRE的菌种类型、总体耐药率及不同菌种的个体耐药率等进行统计分析。结果:本研究共收集到124株CRE菌株,其中包括肺炎克雷伯菌84株(67.7%)、阴沟肠杆菌24株(19.4%)、大肠埃希菌10株(8.1%)及产酸克雷伯菌6株(4.8%)。所有CRE菌株对头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟等头孢菌素类抗菌药物均表现出耐药性;超过80.0%的分离株对妥布霉素和复方新诺明不敏感(中介或耐药);对庆大霉素、哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星和替加环素不敏感率分别为56.5%、46.8%、38.7%和20.2%。不同菌种之间的耐药情况存在一定差异,肺炎克雷伯菌耐药率相对较低,对哌拉西林/他唑巴坦、环丙沙星和替加环素的不敏感率均小于30%;阴沟肠杆菌对亚胺培南和美罗培南不敏感率较低(均为25.0%),对庆大霉素、妥布霉素和哌拉西林/他唑巴坦不敏感率均为75.0%,对环丙沙星和替加环素不敏感率超过40.0%;大肠埃希菌对哌拉西林/他唑巴坦和环丙沙星不敏感率分别是90.0%和60.0%;产酸克雷伯菌耐药情况较为严重,除替加环素的不敏感率为16.7%外,对其他检测抗菌药物全部表现出耐药性。结论:该地区出现多株CRE感染,其中以肺炎克雷伯菌为主,菌株呈现出多重耐药性。不同菌种之间的耐药情况存在一定差异,肺炎克雷伯菌耐药率相对较低,而阴沟肠杆菌、大肠埃希菌及产酸克雷伯菌较高。耐药性的分析有利于发现菌株的耐药趋势,并针对以后的致病菌感染进行经验性抗菌药物治疗。第二部分耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌耐药表型及基因型研究目的:研究CRE的耐药表型及基因型,探讨Vitek 2专家系统(applied expert systems,AES)和MHT在检测肠杆菌科细菌产碳青霉烯酶中的应用价值。方法:应用MHT检测研究菌株的产碳青霉烯酶表型,并根据Vitek 2仪器AES进行产酶结果的判读。利用PCR技术对碳青霉烯酶基因型blaKPC、blaVIM、blaIMP、blaNDM-1及blaOXA-48进行扩增并测序确定耐药基因型,阳性菌株信息注册到Genebank以获取基因序列号。以基因测序的结果为金标准,统计分析MHT和AES在肠杆菌科产碳青霉烯酶检测中的各项性能指标。结果:通过MHT检测CRE产酶表型阳性菌株共102株,占总例数的82.3%,其中肺炎克雷伯菌阳性比例为83.3%,阴沟肠杆菌为75.0%,大肠埃希菌为80.0%,产酸克雷伯菌为100.0%。通过AES检测阳性菌株116株,肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌及产酸克雷伯菌产酶菌株占对应菌株的比例分别为95.2%、91.7%、80.0%及100.0%。经PCR扩增和测序确认了产IMP-4型碳青霉烯酶菌株54株,包含肺炎克雷伯菌42株,阴沟肠杆菌8株及产酸克雷伯菌4株;40株菌产IMP-8型碳青霉烯酶,包含肺炎克雷伯菌20株,阴沟肠杆菌12株,大肠杆菌6株及产酸克雷伯菌2株,其他30株细菌未检出碳青霉烯酶基因型。在产IMP型酶肠杆菌科细菌中,以MHT检测耐药表型的灵敏度为97.9%,特异性为66.7%,检验效能为90.3%,阴性预测值为90.9%,阳性预测值为90.2%;AES检测耐药表型的灵敏度为100.0%,特异性为26.7%,检验效能为82.3%,阴性预测值为100.0%,阳性预测值为81.0%。结论:本地区CRE菌株的主要耐药机制是产IMP型碳青霉烯酶,IMP-4型和IMP-8型MBLs是产酶的主要型别。MHT及Vitek 2系统的AES对肠杆菌科产IMP型酶表型检测均表现出较高的敏感性,可用于早期提示菌株的产酶信息以便及时采取隔离措施。第三部分产IMP型金属酶肠杆菌科细菌的分子流行病学研究目的:分析产IMP型CRE感染菌株的分子流行病学,探讨Vitek MS质谱技术在CRE菌株同源性分析中的应用价值。方法:对收集到的CRE菌株以脉冲场凝胶电泳(pulsed field gel electrophoresis,PFGE)进行同源性分析,根据Tenover标准判读结果。同时以Vitek MS质谱仪的SuperSpectrum功能进行菌株的蛋白峰值的聚类分析,其结果与PFGE同源性的结果进行比较。结果:根据Tenover标准对PFGE结果进行判读,84株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌共分为11种不同的PFGE-DNA谱型(A-K),其中42株产IMP-4型酶肺炎克雷伯菌中,19株为同一谱型(A型),14株为B型,6株为C型,其余3株为独立的基因型(D型、E型、F型);20株产IMP-8型金属酶的肺炎克雷伯菌中,12株为相同的G型,8株为相同的H型;其他未检测到碳青霉烯酶的22株肺炎克雷伯菌分属于3类克隆基因型(I型、J型、K型)。耐碳青霉烯类阴沟肠杆菌24株共8种PFGE-DNA谱型(A-H),其中产IMP-4型酶菌株8株,6株为A型,其他为B型;产IMP-8金属酶12株,分属不同的基因型(C型、D型、E型、F型);其余4株不产碳青霉烯酶菌株属于G型和H型。耐碳青霉烯类大肠埃希菌10株分属于PFGE-DNA谱型(A-E)。6株耐碳青霉烯酶类产酸克雷伯菌分属于PFGE-DNA谱型(A-C)。Vitek MS质谱仪的SuperSpectrum软件蛋白峰值聚类分析结果与PFGE有一定的相似性,肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、大肠埃希菌及产酸克雷伯菌的误差率分别9.5%(8例),12.5%(3例)、10%(1例)及16.7%(1 例)。结论:聊城地区出现在不同医院、不同科室的产IMP型酶CRE菌株有一定的同源性,菌株已经产生了部分区域的局部流行。Vitek MS质谱技术可初步应用于CRE菌株的同源性分析,准确的同源性分型仍需进行PFGE检测。第四部分耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床感染及治疗资料分析目的:分析CRE感染患者的临床感染资料,对感染高危因素和治疗方案进行回顾性分析,探讨产IMP型酶CRE菌株的防控及治疗的合理方案。方法:收集CRE菌株感染患者的各项临床病史资料,包括基本信息、治疗及预后等。感染类型划分为呼吸机相关性细菌性肺炎(ventilator-associated bacterial pneumonia,VABP),菌血症,复杂尿路感染(complicated urinary tract infection,cUTI)急性肾盂肾炎(acute pyelonephritis,AP),医院获得性细菌性肺炎(hospital-acquired bacterial pneumonia,HABP),浅表伤口感染(superficial wound infection,SWI),胆道感染(biliary tract infection,BTI),深部伤口感染(deep wound infection,DWI)和无菌体液感染(sterile body fluids infection,SBFI)。选择同时期感染碳青霉烯类敏感肠杆菌科细菌的患者资料作为对照组,分析性别、年龄、住院天数、侵袭性操作、床位的更换、抗菌药物应用及预后的差异,采用SPSS 18.0软件对数据进行统计分析。结果:根据感染类型分类,CRE感染病例包括31例VABP,22例菌血症,18例 cUTI/AP,16 例 HABP,16 例 SWI,9 例 BTI,7 例 DWI 和 5 例 SBFI。感染患者中免疫功能受损明显(26.6%,33/124),严重脓毒症占比例较高(34.7%,43/124)。大多数患者采用单药经验性治疗,而目的性治疗多采用二联抗菌药物治疗。CRE感染预后较差(28天死亡率为22.6%,28/124),部分感染患者根据药敏结果采用氟喹诺酮类药物治疗,达到了良好的效果。对照研究显示两组之间总住院天数、侵袭性操作、床位更换次数有显著统计学意义(P<0.01)。菌株检出前碳青霉烯类抗菌药物的使用在两组中有差异(P<0.05)。结论:本地区出现的产IMP型MBLs为主的CRE菌株已引发多个部位感染,感染患者往往具有较差的状态、严重的合并症及较高的死亡率,长期住院、侵袭性操作及碳青霉烯类药物的使用是CRE感染的高危因素。在药敏结果的提示下选择喹诺酮类抗菌药物可有效治疗部分产IMP型CRE菌株的感染。