论文部分内容阅读
目的:观察单纯环境因素诱导的小鼠干眼模型的角膜淋巴管新生情况，探讨干眼角膜淋巴管新生与炎症之间的关系，以及分析秦皮滴眼液抑制淋巴管新生改善和治疗干眼的相关分子调控机理和潜力，从而为干眼的发病机制研究及治疗提供一个新的思路与途径。 方法:将4-6周龄Balb/c雌性小鼠随机分为正常对照组、干眼模型组和秦皮治疗组三组，正常对照组小鼠饲养于普通环境中(T:24℃-26℃，RH:60％-75％)，干眼模型组和秦皮治疗组小鼠饲养于温度、相对湿度得到严格控制的温控-湿控调节系统中（T:25.5℃±2.8℃，RH:12.5％±1.5％）。秦皮治疗组小鼠予以上海中医药大学附属龙华医院自制试剂秦皮滴眼液点眼，每日5次，每次2ul，正常对照组和干眼模型组小鼠不予点眼药。 1.通过各组小鼠的泪液分泌量（酚红棉线试验）、泪液蕨样变试验、病理组织学检测（角膜HE染色、结膜PAS染色）等指标进行干眼的评估和论证秦皮滴眼液对干眼的疗效; 2.以CD31作为血管内皮细胞的标记，LYVE-1作为淋巴管内皮细胞特异性标记，对角膜切片进行免疫荧光染色，并行电镜检查，以确定在干眼发病过程中是否形成了角膜新生淋巴管，并观察角膜新生淋巴管的形态及随时间的生长变化趋势，同时确认干眼角膜淋巴管新生过程中是否伴随有平行生长的新生血管; 3.采用Western blot、Real-time PCR和免疫组织化学染色检测三组小鼠角膜组织中促淋巴管生长因子VEGF-C、VEGFR-3的表达，观察淋巴管生长变化趋势与VEGF-C、VEGFR-3表达之间的关系及秦皮滴眼液对其的作用; 4.使用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的IFN-γ、IL-1β、IL-6、TGF-β1、IL-10等细胞因子水平，免疫荧光染色检测角膜CD4+T细胞浸润情况，观察干眼模型的炎症变化情况及秦皮滴眼液对其的作用。 结果:严格控制温度、相对湿度等环境条件，成功建立温控-湿控调节系统，达到造模需求条件（T:25.5℃±2.8℃，RH:12.5％±1.5％）。三组小鼠的泪液分泌量在基点处（第0天）相近，干眼模型组小鼠随着干燥时间的延长泪液分泌量逐渐减少;蕨类物逐渐稀疏断裂甚至消失;角膜上皮细胞分层结构紊乱且细胞层数增多，至第28天可见角膜上皮明显增厚;结膜柱状上皮出现鳞状化生，杯状细胞密度明显减小;角膜淋巴管新生随时间逐渐向角膜中央生长，淋巴管的管径及面积增加;Western-blot、Real-time PCR及免疫组织化学染色可见VEGF-C及VEGFR-3两者的表达量逐渐上升;CD4+T细胞在角膜中的浸润情况和IL-1β、IL-6促炎细胞因子随干燥时间延长而不断上升，而抗炎细胞因子TGF-β1、IL-10随干燥时间表达下降，IFN-γ未见明显改变;秦皮治疗组小鼠相较于干眼模型组小鼠，泪液分泌量及蕨类晶体形态均随着用药时间的延续而逐渐好转;角膜上皮组织结构较为良好，厚度未见明显变化;杯状细胞密度稍减少;角膜周边出现少许淋巴管新生，且随用药时间逐渐减少，中央未见淋巴管新生;秦皮治疗组小鼠VEGF-C及VEGFR-3两个蛋白表达水平较干眼模型组显著下降;未见明显的CD4+T细胞浸润情况;IL-1β、IL-6表达水平较干眼模型组下降，TGF-β1、IL-10表达水平较干眼模型组明显上升，IFN-γ未见明显改变。 结论:温控-湿控调节系统通过严格调控温度、相对湿度，成功建立小鼠干眼模型。干眼发病过程中角膜仅出现淋巴管新生而不伴随血管新生，且新生淋巴管的生长趋势与VEGF-C、VEGFR-3表达密切相关，干燥应力引起眼表IL-1β、IL-6促炎细胞因子高水平表达，而抗炎细胞因子TGF-β1、IL-10低水平表达，及CD4+T细胞浸润增加;秦皮滴眼液可以通过抑制VEGF-C/VEGFR-3信号通路的激活及降低VEGF-C、VEGFR-3转录水平，降低促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达及增加抗炎细胞因子TGF-β1、IL-10表达水平，减轻角膜CD4+T细胞浸润情况，从而抑制和减轻由于干眼引起的淋巴管新生和眼表炎症、角膜上皮的病变。