本研究分为如下二部分： 一、肝癌癌蛋白p28GANK调控NF-κB/RelA信号传导调控的研究 目的：近年来对p28GANK基因的研究也在深入，但它与NF-κB之间的作用和联系尚未见报道。文中预实验结果显示，癌蛋白p28GANK的高表达和低表达均可调控NF-κB的出入核及转录活性，且不依赖于IκBa蛋白的磷酸化及表达量的变化，提示癌蛋白p28GANK可能以独特的方式调控NF-κB信号通路。因此，癌蛋白p28GANK调控核转录因子NF-κB信号通路机制的探讨是极有意义的。 方法：1.构建p28GANK和IκBaGST融合质粒，构建含有Myc标签的p28GANK全长及各种突变体融合质粒，含有Flag标签的RelA全长及各种突变体融合质粒。2.运用双荧光素酶报告基因系统检测外转p28GANK对NF-κB转录活性的影响。3.通过核抽提、EMSA和Suppershift技术，293T细胞瞬转p28GANK后，检测NF-κBDNA-binding活性的变化。4.运用Westernblot及核浆分离技术，检测293T细胞瞬转p28GANK后，NF-κB的RelA/P65亚基在胞核胞浆中的分布变化；肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAip28GANK后RelA/P65在胞内的分布变化。5.运用细胞免疫荧光技术检测293A细胞共转p28GANK和NF-κB(RelA/P65)后，NF-κBRelA/P65在细胞内定位的变化。6.构建IκBa、IκBB和IκBeRNA干扰质粒，选用HepG2，HeLa和HEK293细胞建立IκBa、IκBB和IκBe共同下调稳定细胞系(又称为3KD细胞)，检测p28GANK在3KD细胞中对NF-κB转录活性、DNA-binding及细胞内分布的影响。7.运用免疫共沉淀(IP)、GST-pulldown和激光共聚焦技术研究p28GANK与NF-κBRelA/P65及其各种突变体是否存在直接相互作用。8.运用Westernblot和IKK激酶活性分析技术检测293T细胞外转p28GANK和肿瘤细胞下调p28GANK后，IKK磷酸化、蛋白量以及激酶活性的改变。9.化学合成针对RSK-1的小干扰RNA(siRNA)，检测p28GANK在p53缺失的细胞中或干扰下调RSK-1的情况下对NF-κB活性的调控。10.Westernblot检测293T细胞外转的p28GANK及肿瘤细胞中内源的p28GANK对TNF-α、LPS和IL-1β等刺激的应答变化。 结果：1.p28GANK抑制本底和几种处理(共转RelA/P65或TNF-α刺激)活化的NF-κB转录活性，选用高表达p28GANK的HepG2(p53野生型)、Hep3B(p53缺失型)、HuH-7(p53点突变型)和HeLa(p53野生型)四种肿瘤细胞系，经腺病毒介导的RNAi干扰p28GANK24-72hr后，NF-κB转录活性升高。2.发现p28GANK通过抑制异源二聚体RelA/p50与DNA的结合，减弱NF-κBDNA-binding活性，肿瘤细胞系经腺病毒介导的RNAi干扰p28GANK后NF-κBDNA-binding活性增强。3.Westernblot和细胞免疫荧光显示293T细胞瞬转p28GANK后，随着p28GANK量增加，RelA总量不变，但由胞核转至胞浆，内源的IκBα不受影响；Hep3B、HepG2和HeLa细胞经腺病毒介导的RNAip28GANK后RelA重新入核。4.在3KD细胞中，p28GANK仍可调控NF-κB的转录活性和DNA-binding活性，即p28GANK对NF-κB的调节不依赖于IκBs蛋白。5.免疫共沉淀(IP)、GST-pulldown和激光共聚焦结果显示p28GANK与NF-κB/RelA直接相互作用，并利用其N端的出核序列，通过CRM-1途径促使NF-κB/RelA出核。6.Western blot技术和IKKB激酶活性分析表明293T细胞外转p28GANK和肿瘤细胞下调p28GANK不影响IKKB的磷酸化状态、表达量以及激酶活性，即p28GANK对NF-κB/RelA的调节不需要IKKB的参与。 结论：肝癌癌蛋白p28GANK可与：RelA.直接结合并通过CRM-1途径促使其出核，进而使RelA阻滞于胞浆并明显地抑制其转录活性。下调肝癌细胞中p28GANK的表达使NF-κB复合物在胞浆中得以释放、游离并重新入核结合靶DNA而活化。在3KD细胞及p53缺失的细胞中，p28GANK仍可与RelA直接结合并明显地抑制NF-κB/RelA的活性，这表明p28GANK对NF-κB/RelA活性的调节与IκB家族无关且不依赖p53-RSK1.通路。同时，p28GANK引起的NF-κB胞浆阻滞对各种促炎刺激不应答，而且过表达或下调p28GANK调控NF-κB活性的过程不需要IKKB的参与，这些结果表明p28GANK对于NF-κB/RelA活性的调节是一不同于传统方式的全新分子机制。近来有人报道了另一肝癌癌蛋白HSCO(HepatomaSubtracted-cDNAlibraryCloneOne)也可直接促使NF-κB出核而抑制其活性，由此抑制p53引发的凋亡，这提示在肝癌信号网络调控中确实存在新的非经典的NF-κB调节途径。我们认为，p28GANK作为一全新的NF-κB/RelA活性调节子，在RelA的胞浆阻滞和刺激不应答过程中发挥着独特的作用，这是对NF-κB通路调控机制的新发现和补充，亦有助于进一步阐明肝细胞癌发生发展过程中精细分子机制。 二、肝癌癌蛋白p28GANK抗凋亡机制的研究。 选用了高表达p28GANK的肝细胞癌细胞系HepG2运用反义遗传方法(RNAinterference,RNAi)干扰p28GANK基因的表达，TUNNEL和细胞流式分析都显示细胞出现了大量凋亡。WesternBlot检测显示caspase-8和caspase-9被切割激活，caspase-3的底物PARP被切割，提示凋亡过程是依赖于caspase酶的激活。caspase-8和caspase-9分别是死亡受体凋亡途径和线粒体凋亡途径的启动caspase，进一步用二者的抑制剂研究其在这个凋亡过程中所扮演的角色。 本文的研究表明：干扰p28GANK基因表达后，肝癌细胞的线粒体跨膜膜电位(mitochondrialtransmembranepotentiaI,Δψm)降低和细胞色素C的释放，而这些都是线粒体依赖性凋亡途径的特征性表现，而且△ψm稳定剂BongkrekicAcid(BA)可明显抑制细胞色素C的释放、PARP的切割和凋亡的发生，这些结果都提示线粒体功能异常参与了干扰p28GANK基因表达引发的肝癌细胞的凋亡。Bcl-2家族蛋白是线粒体依赖性凋亡途径的的重要调节因子，其促凋亡成员和抑凋亡成员之间的平衡是维系细胞正常的重要因素，一旦二者之间失去平衡，细胞便可发生调亡。我们的研究结果显示，干扰p28GANK基因表达后，Bcl-2家族的促凋亡蛋白Bax上调并向线粒体移位，抑凋亡蛋白Bcl-XL下调。鉴于HepG2细胞中存在野生型p53这个背景，而且p53也是一个重要的促凋亡因子，我们研究了干扰p28GANK基因表达对p53功能的影响，结果显示在HepG2细胞中，干扰p28GANK基因表达可导致p53向线粒体的移位以及随后的p53在细胞核内的聚集，报告基因分析显示p53转录活性增加，其靶蛋白Bax上调也证明了这一点，这些结果提示，p53可能通过转录依赖和非依赖性两条途径参与了干扰p28GANK基因表达引发的HepG2细胞的凋亡。 文中进一步检测了干扰p28GANK基因表达对细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)家族的影响，WesternBlot结果显示干扰p28GANK基因表达导致JNK和p38MAPK的磷酸化，p38MAPK的抑制剂SB203580可明显抑制PARP的切割和凋亡的发生，而JNK的抑制剂SP600125则没有明显的抑制作用，而且SB203580明显抑制了Bax和p53向线粒体的移位、p53在核内的聚集和它转录活性的升高以及△ψm的降低，这些结果显示p38MAPK在干扰p28GANK基因表达引发的细胞凋亡中起关键的调节作用。我们进一步检测了干扰p28GANK基因表达对活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)的影响，结果显示干扰p28GANK基因表达导致细胞内ROS生成增加，抗氧化剂N-acetyl-L-cystenine(NAC)可明显抑制p38MAPK的磷酸化、PARP的切割和凋亡的发生，这说明ROS的过量产生是干扰p28GANK基因表达引发肝癌细胞凋亡的上游事件，它通过p38MAPK发挥其促凋亡作用。 本文成功地运用了腺病毒介导的RNA干扰技术沉默肝癌细胞HepG2中癌基因p28GANK的表达，从而诱导其凋亡，并进一步阐明这个凋亡过程的机制，同时由于p28GANK基因在肝癌中特异性高表达，认为p28GANK基因可以作为肝癌生物治疗的有效靶点。