研究背景糖尿病下肢血管病变(lower extremity arterial disease,LEAD)是糖尿病常见的并发症,据统计,LEAD是糖尿病患者住院的常见原因,可导致患者足溃疡、坏疽甚至截肢,使患者失去正常活动能力,医疗费用每年超过10亿美元[1]。在全球,超过半数的下肢截肢与糖尿病有关。经皮腔内血管成形术(percutaneous transluminal angioplasty,PTA)是一种经典的微创治疗方法,适用于对内科保守治疗无效且不能耐受手术的患者,血管内支架成形术和经皮球囊扩张血管成形术是两种主流的介入术式。球囊扩张术是利用扩张球囊产生一定的压力挤压斑块,使斑块断裂回缩,从而再通被斑块阻塞的血管管腔;而支架成形术则通过向斑块形成的血管内放入支架以挤压斑块来扩张被阻塞的血管[2]。对于提高腘以下动脉的长期通畅率的疗效,支架成形术仍存在争议,并且糖尿病LEAD的病变范围主要在腘动脉的下行部位——胫、腓动脉和分支动脉,该部位由于血管较细、运动强度比较大,不适合应用支架,因此,经皮球囊扩张血管成形术就成为了LEAD的主要治疗方式,目前,狭义PTA是指经皮球囊扩张血管成形术。然而,据不完全统计,PTA术后1年再狭窄(Restenosis,RS)率约为50%-70%[31,严重降低了PTA的远期疗效,影响患者的预后。因此,阐明PTA术后RS的发病机制,防止RS的发生,是当前治疗外周血管疾病所关注的热点问题,是推进糖尿病LEAD治疗进程的关键。研究目的构建再狭窄动物模型,明确Lin28a在糖尿病下肢血管病变球扩后再狭窄斑块中的高表达情况,并进一步通过细胞实验研究其作用机制。研究方法第一部分:选取1月大的90-100g SD大鼠,用正常饲料喂养一个星期,再给予高脂饲料喂养,体重达300g时行腹腔葡萄糖耐量试验(intraperitoneal glucose tolerance test,IPGTT)、胰岛素敏感性试验(intraperitoneal insulin tolerance test,IPITT)检测,筛选出胰岛素抵抗的大鼠,予以腹腔注射低剂量链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)27.5mg/kg的方式构建2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠模型,连续两次测得空腹血糖≥ 11.1mmol/l,并且具有“三多”症状(多尿、多饮、多食)的大鼠则认为T2DM造模成功。成模后随机分为以下2组:动脉粥样硬化组(AS组)和再狭窄组(RS组)。AS组予以球囊拉伤术构建动脉粥样硬化斑块模型,RS组予以球囊拉伤联合球囊扩张术构建再狭窄斑块模型。两组分别在术前、术后4周行多普勒超声检查斑块形成情况。实验结束后,过量麻药处死动物,用苏木素-伊红(HE)染色血管组织以确定两组模型的成功构建。免疫组化检测α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、Lin28a在两种斑块内的差异性表达情况,免疫荧光双染检测α-SMA和Lin28a组织内共表达情况,qRT-PCR检测两组斑块内Lin28a表达变化情况。第二部分:大鼠主动脉血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)提取、培养和鉴定后,慢病毒干预平滑肌细胞内Lin28a的表达,分为以下3组:A:Lin28a过表达慢病毒转染VSMCs(Lin28a+),B:携带GFP空载质慢病毒转染VSMCs(control),C:Lin28a干扰病毒转染VSMCs(Lin28a-)。采用免疫印记法(Western blot)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3组Lin28a的表达,明确Lin28a干预的效果。采用EdU法、Transwell小室来分别检测VSMCs的增殖能力和迁移能力。统计学分析:数据应用均值±标准差(mean±SE)来表示,使用统计软件SPSS 21.0进行统计学分析,采用非配对t检验的方法来进行两组之间差异性的分析。如果P<0.05,则两组间的差异被认为是有统计学意义的(双侧)。研究结果第一部分:1、动物一般情况:40只大鼠高脂饲至体重达300g后,经IPGTT、IPITT检测均产生胰岛素抵抗。腹腔注射STZ后,共30只大鼠成功达到了 T2DM的造模标准,并排除了血糖未达标的大鼠。实验结束后,AS组剩余8只,RS组剩余7只。两组大鼠基线数据(体重、血糖水平)在统计学上没有差异(P>0.05)(见表1)。2、超声检测结果:于球囊拉伤前行超声检查,可见血管通畅(图1A),球囊拉伤术后4周对大鼠进行超声检查,两组可见低回声斑块(图1B);RS组PTA术后1周,超声检测髂内动脉狭窄部位血流恢复(图1C)。PTA术后4周,RS组再次超声检测髂内动脉,可见管腔再次狭窄,血流信号减弱,有低回声斑块形成(图1D),提示形成再狭窄斑块。3、斑块组成成分及Lin28a表达情况结果:AS组的HE染色显示大鼠血管狭窄和粥样硬化斑块形成(图2A)。RS组观察到大鼠血管的管腔狭窄,大量新生的细胞呈无序排列(图2B)。α-SMA和Lin28a免疫组化染色结果显示:AS组血管斑块中的VSMCs较少见,而RS组斑块中则充满VSMCs(图3);AS组Lin28a阳染细胞较少,但在RS组的阳染数显著高于AS组(图4)(P<0.05)。α-SMA和Lin28a免疫荧光双染结果显示:Lin28a阳染的细胞α-SMA染色也是阳性(图5)。4、qRT-PCR结果显示:相比于AS组,RS组内Lin28a在mRNA水平升高明显(图6)(P<0.05)。第二部分:1、大鼠原代主动脉血管平滑肌细胞的提取、培养和鉴定:采用组织贴块法成功提取大鼠原代主动脉血管平滑肌细胞,免疫荧光显示提取的细胞表达α-SMA和SM-22。2、慢病毒感染复数(MOI)检测结果:选取MO1=20为感染复数转染细胞。3、Western blotting、、qRT-PCR:各组Lin28a蛋白和mRNA含量结果显示:与空载病毒组相比,干扰组Lin28a在蛋白水平和mRNA水平均表达下降(P<0.05),过表达组Lin28a表达上调(P<0.05)(图 10)。4、EdU法检测细胞增殖能力:与空载病毒组相比,Lin28a干扰组细胞增殖数减少(P<0.05);Lin28a过表达组细胞增殖数量增加(P<0.05)(图11)。5、细胞迁移实验:抑制Lin28a表达,细胞迁移数量明显低于对照组(P<0.05);过表达组中细胞迁移的数量增加(P<0.05)(图12)。研究结论1、体内实验表明,在RS斑块中,构成斑块的主要成分是平滑肌细胞,同时,在斑块内Lin28a在蛋白和mRNA水平表达均升高。2、体外实验表明,过表达平滑肌细胞的Lin28a,可促进细胞迁移与增殖,而抑制细胞内Lin28a的表达后则可以抑制平滑肌细胞迁移与增殖,对RS的形成具有预防作用。