目的1.建立生物检材中氯氮平的气相色谱和气相色谱/质谱检测方法;2.建立氯氮平的毒物动力学、动态分布、死后分布、死后再分布、死后弥散、分解动力学动物模型;3.研究氯氮平在实验动物体内的毒物动力学、动态分布、死后分布、死后再分布、分解动力学规律,为氯氮平中毒(死)案件的法医学鉴定提供实验依据。方法1.样品的处理和气相色谱、气相色谱/质谱检测:血、组织样品中加入内标物SKF525A,经0.5moL/L NaOH溶液调pH=10,乙醚萃取,薄层色谱扫描、气相色谱、气相色谱/质谱联用法定性,定量检测氯氮平含量。2.毒物动力学:雄性家兔6只,随即分为两组,分别用1/2LD50(135 mg/kg)与LD50(270 mg/kg)剂量灌胃,于灌胃后1、1.5、2、3、5、7、9、13 h颈动脉取血1mL。GC/MS和GC定性、定量检测其中氯氮平含量。采用winNonlin药代动力学软件处理平均药物浓度时间数据,根据AIC信息判据选择模型,计算毒物动力学参数。3.动态分布:雄性wistar大鼠27只,经灌胃匀速注入1/4LD50(65mg/kg)氯氮平,分别于给药后1、2、3、3.5、4、4.5、5、6、8h处死大鼠,取心血、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑。心血加入肝素抗凝,4℃冰箱保存,其余脏器冷冻保存,样品经提取后进行薄层色谱检测。4.死后分布:家兔6只,随机分为两组,分别LD50(270 mg/kg)、4LD50(1080 mg/kg)灌胃,死亡当时,迅速解剖动物,取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑等冷冻保存,碱性乙醚提取,GC/MS和GC定性定量检测其中氯氮平含量。5.死后再分布:Wistar大鼠,162只,雄性,随机分为3组,随机选择2组1/2 LD50 (130 mg/kg)氯氮平灌胃,另一组治疗量灌胃,2h达峰时立即处死。1/2 LD50灌胃的2组中随机抽取一组去胃后,置于室温(20?C)条件下,于死后0、2、4、8、12、24、48、72、96h取心血-20?C保存待检。家兔,48只,雄性,体重2000±500g,随机分为两组,其中一组结扎门静脉,分别LD50(270 mg/kg)灌胃,2h达峰时立即处死,仰卧位置于室温(20?C)条件下,于死后0、2、4、8、12、24、48、72h各组分别取3只家兔心血,-20℃冰箱保存待检。解冻,液-液萃取血液,GC/MS和GC法定性、定量检测氯氮平含量。6.死后弥散:雄性家兔33只,随机分为死后弥散组(15只)、温度影响组(6只)、剂量影响组(6只)、灌胃时间影响组(6只)。死后弥散组:将家兔固定于兔台上,插胃管后,夹闭气管处死;死后1h后,LD50(270mg/kg)氯氮平灌胃染毒,将染毒后家兔置于常温环境下,分别于0.5d、1d、2d、4d、6d各解剖3只家兔,取心、肝、脾、肺、肾、脑、左下肢肌、右下肢肌、心血、周围血、玻璃体液、尿、胆汁,置于-20℃冰箱内保存待检。温度影响组:将家兔固定于兔台上,插胃管后,夹闭气管处死;死后1h后,LD50(270 mg/kg)氯氮平灌胃染毒,将染毒后家兔(各3只)分别置于-20℃、4℃和常温环境下,4d解剖动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑、左下肢肌、右下肢肌、心血、周围血、玻璃体液、尿、胆汁,置于-20℃冰箱内保存待检。剂量影响组:将家兔固定于兔台上,插胃管后,夹闭气管处死;死后1h后,1/2 LD50与2 LD50氯氮平灌胃染毒,将染毒后家兔置于常温环境下,4d解剖动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑、左下肢肌、右下肢肌、心血、周围血、玻璃体液、尿、胆汁,置于-20℃冰箱内保存待检。灌胃时间影响组:将家兔固定于兔台上,插胃管后,夹闭气管处死;分别于死后3h和6h以LD50(270 mg/kg)氯氮平灌胃染毒,将染毒后家兔置于常温环境下,4d解剖动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑、左下肢肌、右下肢肌、心血、周围血、玻璃体液、尿、胆汁,置于-20℃冰箱内保存待检。7.保存检材中分解动力学:雄性犬6只,4LD50剂量(0.605g/kg)灌胃。灌胃后2h,经股动脉插管采血,肝素抗凝;放血处死,取肝脏。每只犬血分四等份分别置于20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%),每只犬肝分四等份分别置于20℃、4℃、-20℃、20℃(4%甲醛),分别于0、1、7、14、21、35、49、133d取材提取,GC/MS和GC法定性、定量检测其中氯氮平含量。采用WinNonlin药代动力学软件处理平均药物浓度,拟合分解动力学方程,计算分解半衰期。8.用SPSS 13.0通用统计学软件对实验数据进行统计学处理,所有数据结果均用x±s表示,采用方差分析,LSD检验。结果1.气相色谱/质谱检测:气相色谱/质谱分析氯氮平的特征离子为243,256。气相色谱检测,心血中氯氮平气相色谱检测的回归方程Y = 33.396X + 0.9248(μg/mL)、线性检测范围(0.1 -48)μg/mL、相关系数0.985、回收率(92.40±1.0)%、最低检出浓度0.1μg/mL。2.氯氮平在家兔体内的药(毒)物代谢动力学过程呈一级动力学特征,符合一室开放模型。1/2 LD50剂量氯氮平的药(毒)代动力学方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期为Ct = 3.397028(e - 2.57018t - e– 0.27963t)、0.694433h和2.484292h。LD50剂量氯氮平的药(毒)代动力学方程、平均吸收半衰期和平均消除半衰期为为Ct = 2.256018(e - 2.98751t - e– 0.33022t)、1.529528h和3.798686h。3. 1/4LD50剂量氯氮平在大鼠体内的动态分布符合口服给药一级动力学一室开放模型过程,各脏器中氯氮平的动态分布也符合血管外给药一级动力学开放一室模型。心血中达峰时间和消除半衰期除为1.87h和4.91h;各脏器中达峰时间和消除半衰期为2.37~2.99 h和1.27~12.57h。在各组织脏器中的分布情况为心血、心、肝、脑氯氮平含量高,脾、肺、肾中氯氮平含量随时间先升高后降低。4.死后分布:死亡当时家兔各脏器组织氯氮平含量由高到低分别为(t检验,P<0.05):①LD50组:肺(108.63±39.55)>肝(46.38±9.59)、脑(44.79±38.57)、脾(24.56±3.74)、肾(24.14±2.39)>胆汁(9.85±1.96)、心(9.70±4.40)、心血(5.95±0.72)、尿(5.02±0.57)、玻璃体液(4.92±0.55)>下肢肌(4.00±1.28);②4LD50组:肺(273.16±131.24)、肝(269.03±120.75)>脑(178.81±144.44)、脾(103.02±23.48)、肾(96.19±67.38)>胆汁(36.53±25.92)、心(24.48±8.84)、下肢肌(11.57±7.89)、心血(10.26±2.91)、玻璃体液(7.85±4.84)>尿(5.35±0.88)。5.死后再分布:染毒大鼠1/2 LD50去胃组在处死后24h氯氮平浓度显著升高(P<0.05),此时心血浓度与死亡当时心血浓度之比(C24h /C0h)达4.32;1/2 LD50非去胃组在处死后8-24h氯氮平浓度显著升高(P<0.05),此时心血浓度与死亡当时心血浓度之比(C8-24h /C0h)达1.69-3.06;治疗量组在处死后2-48h氯氮平浓度显著升高(P<0.05),此时心血浓度与死亡当时心血浓度之比(C8-24h /C0h)达1.86-3.15。染毒家兔结扎门静脉组在处死后4-48h氯氮平浓度发生降低(P<0.05),此时心血浓度与死亡当时心血浓度之比(C4-48h /C0h)达0.69-0.78。6.死后弥散:家兔处死后1小时LD50氯氮平灌胃染毒,室温下心、肝、肺、肾、左下肢、右下肢、心血在12h可以检测出氯氮平,脑,胆汁在2d开始检出氯氮平;尿中始终未检出氯氮平。常温、4度、-20度条件下左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃体液均未检出氯氮平,-20度时心血、外周血、胆汁、心、肾、脑均未检出氯氮平,肝脏中氯氮平的浓度随着保存温度的降低而降低,且具有统计学意义(P<0.05)。1/2 LD50、LD50、2LD50三种剂量下右下肢肌、尿、胆汁中未检出氯氮平,随着给药剂量增大,心、右下肢肌、玻璃体液中氯氮平浓度增大(P<0.05)。在死后1h、3h、6h三种灌胃时间条件下,左下肢肌、右下肢肌、尿、玻璃体液中均未检出氯氮平,在死后6h灌药,心、肾、胆汁中未检出氯氮平。7.分解动力学:不同条件保存血和肝中氯氮平含量均呈下降趋势,氯氮平在血和肝中的分解动力学呈一级动力学特征,符合一室开放模型。20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%)保存至7d、21d、35d、49d,犬血中氯氮平浓度分别显著下降至最初浓度的28.93%、16.11%、14.06%、0.11%;78.48%、55.14%、53.44%、34.02%;66.27%、38.85%、31.04%、17.70%;91.49%、88.49%、74.07%、68.90%。保存133 d时犬血中氯氮平浓度分别显者下降至最初浓度的0.10%、12.14%、19.28%、62.20%,其分解半衰期分别为:8.31d、19.90d、35.49d、171.16d。20℃、4℃、-20℃、20℃(10%甲醛)保存至7d、21d、35d、49d时犬肝中氯氮平浓度分别显者下降至最初浓度的62.93%、59.88%、50.69%、45.83%;70.73%、75.39%、45.96%、44.67%;77.27%、74.72%、67.97%、58.59%;28.78%、27.95%、23.03%、13.98%。保存133 d时犬肝中氯氮平浓度分别显者下降至最初浓度的43.51%、41.27%、50.19%、10.90%,其分解半衰期分别为:79.40d、82.35d、100.89d、8.88d。结论1.本文建立了生物检材中氯氮平气相色谱/质谱检测方法,选择性好,定性准确,气相色谱检测简便,快速,灵敏,定量结果准确,可应用于氯氮平中毒的临床快速检验诊断和中毒(死)案件的法医学鉴定;建立了氯氮平的毒物动力学、死后分布、死后再分布、死后弥散、分解动力学研究动物模型,可应用于氯氮平的法医毒物动力学研究。2.氯氮平在家兔体内的毒物动力学呈一级动力学过程,符合一室开放模型。染毒剂量增大,其吸收半衰期和消除半衰期均延长大,染毒剂量对氯氮平的代谢动力学有影响。3.氯氮平在大鼠体内动态分布符合口服给药一级动力学一室开放模型,各脏器与血液的C-T曲线大致相似,脏器浓度与血液浓度具有一致的动态变化,吸收半衰期无显著性差异;但是心血、心脏、肝脏与其他脏器的消除半衰期具有显著性差异。说明氯氮平进入体内后,能迅速向各组织器官分布,并达到动态平衡。4.4LD50剂量染毒家兔体内氯氮平含量以肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑居多;LD50剂量染毒家兔体内氯氮平以肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑居多,由此可见不同剂量对氯氮平的死后分布没有影响。5.死后再分布:染毒大鼠1/2 LD50非去胃组8-24h发生死后再分布,而1/2 LD50去胃组在24h发生死后再分布,后者发生死后再分布的时间延迟原因可能为摘除胃,使得药物蓄积库不存在引起的;治疗量组在2-48h发生死后再分布;说明剂量对死后再分布有影响。门静脉结扎家兔组心血中氯氮平浓度降低,原因可能为门静脉被结扎,阻止了死后血液流动。综上可见,去胃和门静脉结扎均影响到死后再分布,说明了蓄积库顺浓度梯度扩散是与死后血液流动是发生死后再分布的机制。同时门静脉结扎也验证了死后血液流动的存在。6.死后弥散:脾、肺、心、肝、肾受死后弥散影响较大,左下肢肌、右下肢肌、玻璃体液、心血、外周血、脑,胆汁受到死后弥散的影响较小,尿液中无影响。温度、灌胃时间对氯氮平死后弥散有影响,灌药剂量对死后弥散影响较小。氯氮平在各脏器中死后弥散不均匀,这可能与药物本身的性质、脏器的血流量、浆蛋白结合率以及与胃的距离远近等许多影响因素有关。7.在20℃、4℃、-20℃、20℃(加NaF至1%)保存条件下,血中氯氮平均呈现下降趋势,可见在NaF添加组中血中氯氮平的降解最慢(P<0.05),其次随着温度降低氯氮平的降解明显减慢;在20℃、4℃、-20℃、20℃(10%甲醛)保存条件下,肝脏中氯氮平均呈现下降趋势,其分解半衰期分别为:79.40d、82.35d、100.89d、8.88d,可见在甲醛添加组中肝脏中氯氮平的降解最快(P<0.05),其次随着温度降低氯氮平的降解明显减慢。说明温度可以影响保存检材中氯氮平的降解,在血中添加NaF可以延缓氯氮平的降解,甲醛保存肝脏会加速氯氮平的降解。实际工作中应该注意检材的送检时间和检材的保存条件。