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目的: 子痫前期(preeclampsia-PE)是指妊娠20周后出现的高血压和蛋白尿。若无蛋白尿症状时,PE诊断为高血压合并血小板减少、肝酶升高、肾功能不全、肺水肿、视觉障碍以及头痛神经系统障碍等全身各个系统的疾病。PE影响着3%-10%的妊娠妇女,是母体和胎儿发病率和死亡率的首要原因。PE发展为子痫,引起抽搐,在产妇中大约有2.7-8.2/10000会发展为子痫。PE可合并脑出血、肝脏破裂、肺水肿、急慢性肾衰、早产、胎儿宫内生长受限、死胎、死产以及孕产妇的死亡等。终止妊娠是PE唯一有效的治疗方法,产后胎盘娩出后患者症状明显好转,说明胎盘是PE发生、发展的主要因素。 胚胎植入后,胎盘形成的过程与子宫内膜微环境相关。早期妊娠时胎盘是在一个相对低氧的环境下形成的,胎盘形成过程,也是氧浓度变化的一个过程,在胚胎着床时,宫腔内的氧含量为3%,而蜕膜和子宫肌层内的氧含量为8%-12%。这个氧浓度梯度促进绒毛外滋养层入侵子宫肌层、蜕膜以及螺旋动脉的重塑。滋养层锚定母体组织,并入侵螺旋动脉内,与血管内皮细胞和平滑肌细胞相互作用,改变螺旋动脉的结构。早孕末期,螺旋动脉管腔内阻塞的滋养层细胞减少直至消失,低阻力、高流量的螺旋动脉形成,母体血液灌注至胎盘绒毛间隙,母胎界面形成。螺旋动脉重塑后胎盘内的氧浓度升高至正常范围。有缺陷的滋养层的入侵和子宫螺旋动脉的重塑障碍引起胎盘的血管收缩和反应性,进而引起缺氧和活性氧的产生,激活低氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α),导致氧化应激。当胎盘缺血、缺氧时,子宫胎盘血供减少,灌注不足,胎盘绒毛状结构被破坏,合成和释放大量血管活性因素,以及促炎性细胞因子、内皮素、合体滋养细胞微泡等胎盘源性不良因子,导致内皮细胞功能障碍,系统性炎症反应,最终引起妊娠20周后高血压、蛋白尿等PE临床症状的发生。目前研究广泛认为胎盘源性不良因子的释放是PE发生、发展的中心通路。 合体滋养细胞胞外体(syncytiotrophoblast exosome,STBEX)是合体滋养细胞产生的胎盘源性不良因子的一种,属于细胞间连接物质,是一种纳米级囊泡。在正常妊娠时,STBEX作为细胞间连接分子,在绒毛外滋养层和血管平滑肌细胞、内皮细胞间起着信号转导作用,在螺旋动脉的重塑过程中发挥着重要作用。同时,STBEX在胎盘和外周血免疫细胞间进行信号传导,促进母体对胎儿的免疫耐受,在母胎界面血管的形成和成功妊娠中发挥着重要的作用。STBEX最早在妊娠第六周时出现于循环血液中,且随着孕周的增加,STBEX的水平明显升高。但在PE等病理妊娠中,STBEX的作用尚未完全阐明。与同孕周的正常妊娠患者相比,PE患者STBEX的水平明显升高。此外研究发现,STBEX可以激活单核细胞,使其分泌IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎性细胞因子和趋化因子,造成类似PE严重的系统性炎症反应。STBEX还可以诱导T细胞的增殖而促进免疫反应。STBEX表面的HLA-G5、B7-H1和B7-H3等免疫分了可以激活抗原提呈细胞,调节Th1/Th2免疫平衡。STBEX可通过多种途径作用于母体,既可以引起导致局部的炎性反应又可以调节全身的系统性免疫反应,被认为是母体炎症因子和免疫平衡两方面的重要调控因素,在PE的发病过程中发挥着重要的作用。 Rab蛋白是GTP酶Ras超家族中最大的分支,在包括真核细胞在内的多种细胞的囊泡转运和信号转导过程中发挥着十分重要的作用。Rab11表达在胎盘组织中,但是其在胎盘中的作用尚未见明确报道。本文旨在探讨PE中,缺氧时Rab11对STBEX过度分泌机制作用研究,以及Rab11蛋白在正常妊娠和PE患者胎盘组织中表达的差异。 方法: 第一部分: 1.用福司可林(Forskolin)融合Bewo细胞,模拟胎盘合体滋养细胞。 2.分别在常氧和缺氧条件下培养融合Bewo细胞和对照组细胞,根据是否融合与培养条件的不同,将细胞分为四组。①BeWo常氧组:BeWo细胞在普通培养基、常氧条件下培养;②BeWo低氧组:Bewo细胞在普通培养基、低氧条件下培养(92% N2、5%CO2,3%O2);③融合BeWo常氧组:BeWo细胞以Forskolin诱导48h后,常氧条件下培养;④融合BeWo低氧组:BeWo细胞以Forskolin诱导48h后,低氧条件下培养(92% N2、5%CO2,3%O2)。 3.BCA法检测各组上清液中STBEX蛋白浓度。 4.Western-blot检测各组细胞中HIF-1α、Rab11蛋白的表达量。 5.用RNA干扰技术沉默HIF-1α后,检测各组细胞Rab11蛋白的表达变化。 第二部分: 1.搜集重庆市第三军医大学大坪医院产科2014年10月-2015年10月住院产妇,选取子痫前期(PE)患者12例作为实验组,正常晚孕产妇12例作为对照组,收集剖宫产后的胎盘组织。 2.分别在常氧条件下和缺氧条件下培养PE胎盘绒毛组织和正常妊娠患者胎盘绒毛组织。分为PE常氧组、PE缺氧组、正常(N)常氧组、正常(N)缺氧组四组。提取各组培养上清液中的STBEX及其蛋白组织,BCA法检测STBEX蛋白浓度。 3.酶联免疫吸附试验(ELISA)法测各组上清液中HIF-1α浓度。 4.Western-blot检测正常妊娠和PE患者胎盘组织中HIF-1α、Rab11蛋白的表达。 结果: 1.与Bewo常氧组比较,Bewo低氧组上清液中STBEX蛋白浓度升高,差异显著(p<0.05);与融合Bewo常氧组比较,融合Bewo低氧组上清液中STBEX的蛋白浓度升高,差异显著(p<0.05); 2.融合Bewo低氧组中HIF-1α、Rab11蛋白表达水平显著高于融合Bewo常氧组,差异具有统计学意义,p<0.05; Bewo低氧组中HIF-1α、Rab11蛋白表达水平显著高于Bewo常氧组,差异具有统计学意义,p<0.05。 3.siRNA干扰,沉默融合细胞HIF-1α后,细胞内的Rab11蛋白表达降低。 4.分别将PE、正常妊娠胎盘绒毛组织在常氧和缺氧条件下培养后,检测上清液中STBEX蛋白浓度和HIF-1α的水平。与PE常氧组相比,PE缺氧组STBEX蛋白浓度与HIF-1α水平升高,差异显著,p<0.05;与正常缺氧组相比,PE缺氧组中STBEX蛋白浓度与HIF-1α水平升高,差异显著,p<0.05;与正常常氧组相比,PE常氧组中STBEX蛋白浓度与HIF-1α水平升高,差异显著,p<0.05。 5.HIF-1α与Rab11蛋白表达在正常妊娠胎盘组织与PE胎盘组织中,与正常胎盘组织相比,PE胎盘组织中HIF-1α、Rab11蛋白的表达量升高,差异具有统计学意义,p<0.05。 结论: 1.低氧条件下,PE胎盘组织中Rab11蛋白表达量明显升高,使STBEX及胎盘囊泡释放增加,可能与PE患者胎盘浅着床有关。 2.低氧环境下,融合Bewo细胞中HIF-1α、Rab11蛋白的表达量升高,用RNA干扰技术沉默融合细胞内HIF-1α后,细胞内的Rab11蛋白表达降低。说明HIF-1α可能通过调控Rab11蛋白来调节STBEX的过度分泌,使内皮细胞功能障碍,促发系统性炎症反应,可能在PE的发生中起一定的作用。