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动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种以动脉壁低度慢性炎症为特征的疾病,并且依赖于细胞间的动态相互作用。单核巨噬细胞是AS炎症反应的主要调节者,血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）常位于巨噬细胞簇附近的血管病变中,明确单核巨噬细胞与VSMCs之间的Crosstalk机制可以为AS疾病的发病机制和新的治疗策略提供重要方向。越来越多的证据表明肠道菌群失调与AS进展之间存在关联,但肠道微生物群在AS发病机制中的作用仍不清楚。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）作为一种分泌型促炎蛋白,通过影响VSMCs的增殖和迁移参与AS的进程,并且其表达受到肠道菌群调控,OPN作为肠道菌群和VSMCs的联系可能为揭示肠道菌群紊乱诱导AS炎症提供新的思考。丹皮酚（Paeonol,Pae）是清热解毒中药牡丹皮中的主要活性成分,具有抗炎、抗AS等药理作用。我们前期的研究已证实Pae对VSMCs的增殖具有一定抑制作用,并且Pae可通过调控肠道菌群抑制血管炎症,尤其是对革兰氏阴性菌丰度的抑制作用。然而,Pae是否通过肠道菌群抑制VSMCs的增殖?及其发挥作用的关键路径和潜在机制尚需进一步探讨。本课题在既往研究基础上,探索菌群-宿主互作机制。以期揭示肠道菌群紊乱导致AS的生物学机制,也为肠源性脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）在低度炎症环境中诱导VSMCs增殖的作用给予进一步解释。阐明Pae抑制VSMCs增殖的菌群相关途径,为肠道菌群紊乱导致AS疾病机制深入研究及Pae从毒论治AS提供科学依据。目的:探讨肠道菌群紊乱与AS进展之间的机制联系,并探索潜在的干预策略。以肠源性LPS为切入点探讨肠道菌群与VSMCs增殖之间可能存在的机制联系;以Pae为工具药,通过靶向肠道菌群评估潜在的干预方法,为Pae治疗AS提供一种基于“肠-血管”轴研究的新思路。方法:高脂饲料喂养Apo E-/-小鼠复制AS小鼠模型,并进行分组。油红O染色和HE染色法观察小鼠主动脉病变;ELISA法检测小鼠血清及粪便中LPS水平;q RT-PCR检测小鼠主动脉和PBMCs中Spp1的m RNA表达水平;Western blot检测主动脉中α-SMA、PCNA、ZO-1、Claudin-1、occludin蛋白表达水平;HE染色观察结肠病理形态学变化;阿利新蓝染色观察结肠黏液层厚度。体外培养THP-1细胞,CCK8法检测细胞活力;Western blot检测主动脉中OPN蛋白表达水平。建立THP-1/VSMCs共培养体系,CCK 8法检测细胞活力;免疫荧光观察p65的核易位;Western blot检测主动脉中p65、IκBα、p-IκBα、p-p65（Ser468）、p-p65（Ser536）、α-SMA、PCNA的蛋白表达水平;Ed U染色观察VSMCs的增殖情况;q RT-PCR检测Spp1、IL-1β、CCL2、CCL5、MMP2、MMP9、ICAM-1的m RNA表达水平。ELISA法检测临床血清样本LPS和OPN的水平。结果:1.肠源性LPS以OPN依赖性的方式促进主动脉VSMCs增殖Apo E-/-小鼠血清中LPS水平异常升高,且LPS刺激促进小鼠VSMCs增殖,增加主动脉斑块的形成;Apo E-/-小鼠主动脉中Spp1表达显著上调且受到肠道菌群的调控,LPS刺激上调了小鼠主动脉和PBMCs中Spp1和炎症因子（IL-1β、CCL2、CCL5）的表达水平;为验证LPS对VSMCs增殖的促进作用是否需要单核巨噬细胞中OPN的参与,体外建立THP-1/VSMCs共培养体系,结果显示:LPS刺激THP-1细胞中OPN的蛋白表达水平上调;LPS刺激的THP-1细胞显著诱导了共培养体系中VSMCs的增殖,OPN中和抗体的干预则逆转了这一促进作用。2.OPN通过αvβ3/NF-κB信号通路促进VSMCs增殖人重组OPN（rh OPN）呈剂量依赖性促进VSMCs的增殖,OPN中和抗体的加入逆转了rh OPN对VSMCs增殖的促进作用;在VSMCs中敲低Spp1基因显著抑制了VSMCs的增殖;rh OPN促进了p65向细胞核的易位,而在rh OPN刺激的同时加入NF-κB抑制剂PDTC,p65向细胞核的易位减弱;rh OPN刺激后,VSMCs细胞核中P65的蛋白表达水平上调,细胞质中p65的蛋白表达则显著降低,PDTC和αvβ3拮抗剂的加入逆转了上述结果;rh OPN刺激促进了VSMCs中NF-κB相关蛋白p65和IκBα的磷酸化水平,上调了NF-κB下游转录因子MMP2、MMP9、ICAM-1的m RNA表达水平;在rh OPN刺激的同时加入PDTC,p65和IκBα的磷酸化水平以及NF-κB下游转录因子MMP2、MMP9、ICAM-1的m RNA表达水平显著下调。3.AS患者血清中LPS与OPN相关性研究AS患者与健康志愿者相比,血清中LPS和OPN水平显著升高,并且AS患者血清中LPS水平的升高与OPN呈显著正相关。4.Pae抑制Apo E-/-小鼠主动脉VSMCs增殖与减少LPS累积有关Pae显著减少AS小鼠主动脉斑块的形成,抑制主动脉VSMCs增殖。粪菌移植结果显示Pae干预小鼠的粪便可以一定程度模拟Pae对主动脉VSMCs增殖的抑制作用;PICRUSt功能预测发现Pae显著减少LPS的体内生物合成路径和LPS生物合成蛋白;结合课题组前期研究和功能预测,我们推测Pae体内抑制VSMCs增殖可能与其对肠源性LPS的调控密切相关,与模型组相比,Pae显著降低了AS小鼠血清和粪便中LPS水平,并且这种降低作用与肠道菌群相关。Pae上调AS小鼠肠道紧密连接蛋白（ZO-1、Claudin-1、occludin）的表达水平,增加结肠黏液层厚度,修复被破坏的肠道屏障;下调小鼠主动脉和PBMCs中Spp1的m RNA表达水平;下调主动脉中NF-κB信号通路相关蛋白p65和IκBα的磷酸化水平以及下游转录因子MMP2、MMP9、ICAM-1的m RNA表达水平。粪菌移植实验显示:接受Pae干预小鼠粪菌后,主动脉中NF-κB信号通路相关蛋白p65和IκBα的磷酸化水平以及下游转录因子MMP2、MMP9、ICAM-1的m RNA表达水平均显著下调。结论:肠源性LPS作为循环单核细胞产生OPN的触发因素,诱导细胞间串扰以促进VSMCs增殖。重要的是,在AS患者血清中也观察到LPS水平的升高与OPN呈显著正相关。Pae可显著抑制AS进程,减少LPS积累,抑制单核细胞/巨噬细胞活化和VSMCs增殖。我们的研究结果为循环血中LPS的长期、低浓度刺激如何产生病理性继发反应提供了一种机制情景,该反应通过循环单核细胞中OPN的高表达导致主动脉VSMCs异常增殖。