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背景与目的:在临床上,外科手术和心脏骤停导致的全脑低灌注是造成全脑缺血(Global cerebral ischemia,GCI)性损伤的重要原因。脑缺血后会引起神经细胞的不可逆死亡,从而导致神经病学和神经行为学上的障碍。在临床上,全脑缺血会导致记忆学习能力下降、痴呆等后遗症。因此,抑制神经细胞的不可逆死亡有望成为改善脑功能的的重要突破口。17-AAG(17-allylamino-demethoxygeldanamycin,17-AAG)即17-丙烯胺基,17-去甲氧基格尔德霉素作为Hsp90抑制剂在临床中是一种有效的抗肿瘤药物。据报道,17-AAG可以通过提高Hsp70的表达水平来保护创伤导致的脑损伤。因此,我们推测17-AAG在GCI中也可能具有重要的保护作用。本研究首先探索17-AAG在大鼠GCI模型中的神经保护作用;其次,分离培养大鼠的海马神经元,通过氧糖剥离/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)模拟大鼠在体GCI脑损伤,然后研究17-AAG对大鼠海马神经元凋亡的保护作用;最后,构建Hsp90表达和Hsp70干扰慢病毒,探讨17-AAG对大鼠海马神经元细胞保护作用的可能分子机制。方法:(1)将90只雌性SD大鼠随机的分成三组:假手术组(Sham)、全脑缺血再灌注组(GCI)、全脑缺血再灌注加17-AAG处理组(17-AAG),通过四血管闭塞法构建大鼠GCI模型。然后,通过TTC实验检测各组大鼠脑梗死体积,TUNEL实验检测神经元的凋亡情况,水迷宫实验检测各组大鼠的学习能力和记忆能力变化,Western blot检测各组大鼠脑组织中Hsp70、Hsp90、LC3B的蛋白表达。(2)分离培养大鼠海马神经元,通过OGD/R模拟大鼠在体GCI脑损伤,OGD时间为0.5h、1h、2h,再灌注时间为24h,TUNEL实验检测OGD/R对各组细胞凋亡的影响,然后Western blot检测OGD/R对各组细胞凋亡标志物Cleaved Caspase-3和自噬指标LC3B II、p62表达的影响。(3)通过TUNEL实验检测不同浓度的17-AAG(0.5μM、1.0μM、2.0μM)对OGD/R处理的神经元的凋亡的影响,然后Western blot检测凋亡标志物Cleaved Caspase-3和自噬指标LC3B II、p62表达的影响。然后,将细胞分为OGD/R组、OGD/R+17-AAG(1.0μM)组、OGD/R+17-AAG(1.0μM)+Rapamycin(1.0n M),通过TUNEL和Western blot研究自噬在17-AAG影响OGD/R处理的神经元凋亡中的角色。(4)通过Western blot研究17-AAG对OGD/R大鼠海马神经元中Hsp70和Hsp90表达的影响。构建Hsp90表达和Hsp70干扰慢病毒,将细胞分成四组:OGD/R+17-AAG+Con、OGD/R+17-AAG+Hsp70sh RNA、OGD/R+17-AAG+NC、OGD/R+17-AAG+Hsp90,通过TUNEL实验检测17-AAG是否通过Hsp90和Hsp70调节OGD/R大鼠海马神经元的凋亡,然后通过Western blot检测17-AAG是否通过Hsp90和Hsp70调节OGD/R大鼠海马神经元凋亡指标Cleaved Caspase-3和自噬指标LC3B II、p62的表达。结果:(1)与GCI组相比,17-AAG组GCI导致的梗死体积明显减少(P<0.01),神经元存活明显增加(P<0.01),大鼠的学习能力和记忆能力明显改善(P<0.01,P<0.01),同时Hsp90和LC3B蛋白表达明显降低(P<0.01,P<0.01),Hsp70蛋白表达明显增加(P<0.01)。(2)与Con组相比,OGD时间为1h和2h时,OGD/R能够明显促进神经元的凋亡百分率的提高(P<0.05,P<0.01);OGD时间为0.5h,1h和2h时,OGD/R均能够明显增强凋亡标志物Cleaved Caspase-3的表达(P<0.05,P<0.01,P<0.01)和自噬。(3)与OGD/R 1h相比,三种浓度的17-AAG(0.5μM、1.0μM、2.0μM)均可以降低OGD/R神经元的凋亡百分率(P<0.05,P<0.01,P<0.01);17-AAG浓度为1.0μM、2.0μM时明显减少OGD/R大鼠海马神经元Cleaved Caspase-3蛋白的表达(P<0.01,P<0.01)和自噬。与OGD/R+17-AAG组相比,OGD/R+17-AAG+Rapamycin组神经元自噬、凋亡的百分率和Cleaved Caspase-3蛋白的表达、均明显升高(P<0.05,P<0.05)。(4)与Con组相比,OGD/R组Hsp70的表达明显降低(P<0.01),而Hsp90的表达明显升高(P<0.01);与OGD/R组相比,OGD/R+17-AAG组细胞中Hsp70的表达明显的升高(P<0.05),而Hsp90的表达明显的降低(P<0.05)。与OGD/R+17-AAG+Con相比,OGD/R+17-AAG+Hsp70 sh RNA组大鼠海马神经元凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白的表达和自噬均明显提高(P<0.01,P<0.05);与OGD/R+17-AAG+NC组相比,OGD/R+17-AAG+Hsp90大鼠海马神经元凋亡率、Cleaved Caspase-3蛋白的表达和自噬也均明显提高(P<0.01,P<0.05)。结论:在GCI动物模型中,GCI导致梗死、神经元死亡、大鼠的学习能力和记忆能力降低;在体外OGD/R实验中,OGD/R促进神经元凋亡,而17-AAG可以降低大鼠梗死体积和神经元死亡百分率并改善学习能力和记忆能力,同时通过Hsp70和Hsp90调节自噬来提高神经元的存活。