目的:卵巢癌是最常见的三大妇科恶性肿瘤之一,因为在解剖结构上卵巢接近于盆腔最深部,早期的病变不易被察觉,而一旦出现了临床症状,已多属晚期。其中上皮性卵巢癌比例最高,达90%,近年来,随着医学的进步,尽管在全面肿瘤细胞减灭术联合化疗方面医疗技术较前有了很大的提高,使得卵巢生殖细胞肿瘤等类别生存率较前有了大幅提高,但上皮性癌的5年生存率却未见明显改善,仍停留在20%~30%,一直处于死亡率最高、预后最差的妇科恶性肿瘤的首位。目前,仍以铂类为基础的联合化疗作为手术治疗卵巢癌的主要辅助方法,但是化疗药物在心理及生理上给患者所带来的一系列不良反应,一定程度上影响了癌症的预后。因此寻找一种既可以降低毒性而又能提高疗效的治疗方法至关重要。近年来,科学家在对膳食纤维的研究过程中发现了一种物质——肌醇六磷酸(inositol hexaphosphate,IP6)——对于肿瘤有着很大的防治作用。美国马里兰大学的Abulkalam M.Shamsuddin博士与美国国家癌症研究院的研究员们经过多年努力,发现IP6具有防治多种疾病的功效。它能抑制肿瘤细胞生长,减小癌灶体积;抗氧化,抑制并杀死自由基;防止生成肾结石;降低血脂浓度;保护心肌细胞免于心脏病发造成猝死;防止动脉发生硬化等。大量文献报道,IP6可以通过调节细胞信号转导通路,或促进或抑制某些基因及蛋白的表达来发挥抗癌作用。但是IP6须与肌醇结合后,才可达到其最佳疗效,因IP6与肌醇作用可以产生IP3,从而进一步发挥抗肿瘤作用。目前已有其对大肠癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、乳腺癌等抑瘤作用的动物实验的相关研究及报道,并取得了显著疗效。但IP 6联合肌醇能否在卵巢癌的治疗中发挥作用,目前国内外并未见相关报道,对此我们尚不清楚。本课题研究的主要目的就是通过观察IP6联合肌醇及其与顺铂联用对人上皮性卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的影响,进一步分析IP6联合肌醇对上皮性卵巢癌生长的抑制作用及其对凋亡相关蛋白Bax及基因mi RNA-21表达的影响,探讨IP6联合肌醇诱导上皮性卵巢癌凋亡的作用机理。方法:1细胞培养:运用常规细胞培养技术,培养人上皮性卵巢癌细胞株SKOV3,用来建立裸鼠皮下移植瘤模型。2裸鼠皮下移植瘤模型的建立及实验分组:选取4-6周龄,重16-18g的BALB/c Nude雌性裸小鼠,饲养于SPF级环境中备用。选取对数生长期的SKOV3细胞,消化,制成单细胞悬液,浓度大约为2.5×107个/ml,于无菌环境中接种在裸鼠皮下,每只裸鼠接种0.2ml细胞悬液(约合细胞数5×106个/只)(Fig.1)。接种5天后,选取移植瘤生长良好,直径在3-5mm的裸鼠进行随机分组(Fig.2),每组均设六只,分别为对照组,IP6+肌醇组,顺铂组及IP6+肌醇联合顺铂组(联合用药组)。3实验用药的制备:实验所需的所有药物均用0.9%的氯化钠溶解,现用现配。4给药方法:IP6+肌醇组按照300mg/kg的浓度予以灌胃,每天一次,连续28天;顺铂组予以3mg/kg/d腹腔注射,连续7天;对照组每天分别予以同实验组相同剂量的生理盐水灌胃及腹腔注射;联合用药组则为IP6+肌醇300mg/kg灌胃,同时予以3mg/kg/d顺铂腹腔注射。5裸鼠重量及移植瘤重量及体积的测量:实验开始每天观察裸鼠一般状况,包括精神状态、进食水及排便情况等,分别于用药前及用药后每周称量裸鼠的重量并测量皮下移植瘤的最长径线(a)及最短径线(b),单位为mm,并按照公式V(mm3)=πab2/6计算移植瘤的体积。于停药后24小时终止观察,用脱颈法处死裸鼠,剥取皮下瘤组织,称重,并计算肿瘤抑制率IR(%)=(1-治疗组肿瘤平均体积/对照组肿瘤平均体积)×100%。6免疫组织化学染色检测裸鼠皮下移植瘤组织中Bax蛋白的表达情况:取经4%多聚甲醛固定的移植瘤组织(小于0.5cm×0.5cm×0.1cm)进行免疫组织化学染色,研究移植瘤组织中促凋亡蛋白Bax的表达。7 RT-PCR技术检测移植瘤组织中mi RNA-21的表达:取保存于-80℃冰箱未经任何试剂处理的移植瘤组织,用RT-PCR技术检测其中mi RNA-21的表达。8统计学方法:采用SPSS13.0统计学软件处理实验数据。重复测量数据用重复测量方差分析,多样本均数间比较采用单因素方差分析,两样本均数间比较用t检验,实验结果均以(?)±S表示,等级资料采用K-W-H秩和检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1实验过程顺利。细胞培养过程瘤细胞生长状态良好,取对数生长期细胞成功建立裸鼠皮下移植瘤模型。实验进行中各组裸鼠的一般状况,主要为精神状态,用药开始各组均较用药前精神变差,但随着用药时间的延长,除顺铂组外均较用药开始时有所好转,实验结束时各组由好变差依次为:对照组、IP6+肌醇组、联合用药组、顺铂组。顺铂组及联合用药组在实验开始时体重有所下降,但随着给药时间的延长,最终各组的裸鼠体重较前均有所增长,顺铂组较对照组增长缓慢,差异有统计学意义(P<0.05),其余两组与对照组无明显差异。移植瘤体积各组亦是逐渐增长,各治疗组体积均明显小于对照组,差异有统计学意义,且联合用药组体积明显小于两单独用药组,差异有统计学意义(P<0.05)。实验第29天测得移植瘤重量,各治疗组均小于对照组,差异有统计学意义,且联合用药组瘤重明显小于两单独用药组,差异有统计学意义(P<0.05)。2移植瘤组织中Bax蛋白的表达情况:IP6+肌醇组、顺铂组及联合用药组移植瘤组织中Bax蛋白表达量均高于对照组,差异具有统计学意义且联合用药组明显高于IP6+肌醇组,差异有统计学意义(P<0.05)。而联合用药组与顺铂组间无明显差异。3移植瘤组织中mi RNA-21的表达情况:IP6+肌醇组及联合用药组移植瘤组织中mi RNA-21表达量均低于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而顺铂组与对照组相比无明显差异。结论:1 IP6+肌醇组移植瘤的体积及重量小于对照组,且差异具有统计学意义,说明IP6+肌醇对上皮性卵巢癌具有抑制作用。并且联合用药组瘤组织的体积及重量均明显小于顺铂组,说明二者具有协同的抗癌作用。2 IP6+肌醇组及联合用药组对裸鼠精神状态等一般情况以及对裸鼠体重的影响均小于顺铂组,表明IP6具有低毒副作用的特点,且联合用药能减轻化疗副反应。3 IP6+肌醇组、顺铂组及联合用药组移植瘤组织中Bax蛋白表达均高于对照组,联合用药组高于IP6+肌醇组,且差异具有统计学意义,表明其可能通过增加促凋亡蛋白Bax的表达量促进癌细胞的凋亡而发挥抗癌作用,但二者在增加Bax蛋白表达方面是否有协同作用还需进一步研究。4 IP6+肌醇组及联合用药组移植瘤组织中mi RNA-21表达均低于对照组,且差异具有统计学意义,表明其可能通过下调mi RNA-21的表达来发挥抑瘤作用。