前房相关免疫偏离(anterior chamber—associated immune deviation，ACAID)是指前房引入抗原(人工引入或眼内抗原进入)后，诱导出特异性非补体结合性抗体和细胞毒性T细胞的前体细胞，但不能诱导出迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity，DTH)。ACAID将进入房水的抗原转化成对机体有保护作用的信号，避免有害信号的生成，从而维持眼内免疫微环境的稳定性，保证正常的视功能。此外，ACAID还是维持角膜移植高成功率的关键因素之一，并且对眼内恶性肿瘤的消长和阻止眼内肿瘤的全身转移等均有重要影响。因此，ACAID不但引起了眼科学家的重视，还引起了免疫学家和肿瘤学家的极大兴趣。研究表明，ACAID的形成与眼一脾轴、房水中β-转化生长因子、眼局部解剖结构等多种因素有关，它是眼内一种固有的免疫抑制现象，其本质被认为是Th2细胞激活和Thl细胞受到抑制，是机体的Thl／Th2平衡由Thl免疫应答向Th2免疫应答的免疫偏离。以往的许多报道认为，前房引入抗原后，与Th2细胞相关的细胞因子如IL-4、IL-10等的水平升高，而与Thl细胞相关的细胞因子如IL一2、IFN-γ等的水平降低。最近研究发现，ACAID不仅能够抑制Thl免疫应答如DTH，而且能够抑制Th2免疫应答如哮喘；ACAID中传出支CD8<+>调节性T细胞的形成并不需要Th2性细胞因子(如IL-4、IL-13等)的参与。 因此，ACAID形成的确切机制有待于进一步阐明。 目前，许多关于Th细胞的研究资料主要是采用ELISA等方法来检测Th细胞所分泌的细胞因子的水平，从功能上来区分Thl和Th2细胞亚群；而对于能直接从Th细胞的表型上来区分Thl和Th2细胞的细胞表面分子则知之甚少。 2001年，V.K.K研究小组发现了一个新的基因家族，其结构上含有免疫球蛋白V区和粘蛋白区，因而命名为T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子(Tcell immunoglobulin-and mucin-domain-containing molecules，Tim)家族。其中，Tim-3蛋白作为区分Thl和Th2细胞的表面标志，特异地表达在分化的Thl细胞而不是Th2细胞上，也不表达在初始T细胞、B细胞、巨噬细胞或树突状细胞上。对于Tim-3的功能的系列研究发现，它是Thl细胞的负性调节子，通过与Tim-3配体(Tim-3L)相互作用而抑制Thl免疫应答，在自身免疫性疾病、变态反应性疾病、哮喘等疾病以及外周免疫耐受的形成中发挥重要的调节作用。 ACAID机制是近年来眼科免疫学领域里最重要的研究进展，阐明其调控机制对于研的自身免疫性疾病的发病机制以及发展新的防治策略具有重要的临床意义。目前尚未见Tim分子在该领域的相关研究报道。本课题在BALB/c小鼠前房注射卵白蛋白(ovalbumin，OVA)诱导ACAID，建立动物模型；检测DTH反应以评价在前房注射OVA后的不同时间点ACAID是否诱导成功；获取ACAID诱导过程中的各个时间点的小鼠脾细胞，采用荧光定量PCR方法和流式细胞学方法分别从mRNA和蛋白水平检测ACAID形成过程中Tim-3表达的动态变化，探讨Tim-3分子在ACAID中可能发挥的作用。 本研究利用Tim-3可以作为新的区分Thl和Th2细胞的表面标志，较以往通过检测细胞因子的水平间接地判断Thl/Th2细胞反应更能直观地评价ACAID的Thl/Th2细胞平衡的变化，从而可能为进一步阐明ACAID机制提供新的思路，进而为葡萄膜炎以及其它自身免疫性疾病的防治提供新的调控手段。 一、ACAID模型的诱导和鉴定 目的：采用可溶性蛋白抗原卵白蛋白(OVA)诱导BALB/c小鼠的ACAID模型，以DTH反应评价ACAID的形成，为以后的研究提供可靠的动物模型。 方法：采用乙醚吸入法麻醉动物，实验组小鼠(i.c.+s.c.)先于小鼠右眼前房注射(i.c.)OVA抗原，再分别于前房注射后的第0、3、7、14、21、28天，进行颈项部皮下免疫注射(s.c.)OVA与完全弗氏佐剂(CFA)的混合液(即OVA-CFA)，按照i.c.与s.c.之间所间隔的不同时间点，将实验组分为day 0、3、7、14、21、28亚组；阳性对照组小鼠(positive s.c.)仅进行皮下免疫OVA-CFA；正常对照组小鼠(normal)未接受任何处理。实验组和阳性对照组小鼠均于皮下免疫后的第7天进行耳廓皮内注射(i.d.)OVA，正常对照组小鼠直接进行耳廓皮内注射OVA，观察DTH反应，评价ACAID的形成。 结果：在day 7、14、21、28亚组的实验组小鼠中耳廓肿胀程度与阳性对照组小鼠的耳廓肿胀程度相比，差异均有统计学意义(P＜0.01)，DTH反应受到明显抑制。而在day 0和day 3亚组的实验组小鼠，其耳廓肿胀程度与阳性对照组的耳廓肿胀程度相比，差异无统计学意义(P＞0.05)，DTH反应强烈。 结论：在BALB/c小鼠的前房注射OVA抗原可以成功地诱导出ACAID；在前房注射后的day 0和day 3亚组小鼠，ACAID尚未形成；而在前房注射后的day 7、14、2 1、28亚组小鼠，ACAID诱导成功。以OVA抗原诱导ACAID能够为以后的研究提供稳定可靠的动物模型。 二、ACAID形成过程中脾脏Tim-3 mRNA的动态表达 目的：检测ACAID形成过程中脾脏Tim-3 mRNA表达的动态变化。 方法：在前房注射OVA后的第0、3、7、14、21、28天分别进行皮下 免疫OVA—CFA的实验组(即day 0、3、7、l 4、21、28 i.c+s.c)和阳性对照组(positive s.c.)小鼠均在进行皮下免疫OVA—CFA后的第7天被处死；正常对照组小鼠(normal)未接受任何处理，直接被处死。获取各组小鼠脾脏，采用Trizol一步法提取脾细胞总RNA，逆转录为cDNA，应用荧光定量PCR技术检测Tim-3 mRNA的表达水平。 结果：实验组小鼠的脾脏Tim-3 mRNA的表达水平在前房注射OVA后的day 3亚组中明显增高，与阳性对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；而在前房注射OVA后的day 7亚组中有所降低，但仍高于阳性对照组的表达水平(P<0.01)：在前房注射OVA后的dav 14、2l、28亚组中，Tim-3mRNA的表达水平逐渐接近于正常对照组的水平(P>0.05)。 结论：Tim-3 mRNA在ACAID的形成过程中呈动态变化，其表达水平在前房注射OVA后的day 3亚组中明显升高，早于ACAID的形成时间，提示Tim-3可能参与了ACAID的形成。 三、ACAID形成过程中脾脏Tim-3蛋白的动态表达 目的：检测ACAID形成过程中脾脏Tim-3蛋白表达的动态变化。 方法：在前房注射OVA后的第0、3、7、14、2 1、28天分别进行皮下免疫OVA—CFA的实验组小鼠(i.c.+s.c.)和阳性对照组小鼠(positire s.c.)均在进行皮下免疫OVA—CFA后的第7天被处死；仅接受前房注射OVA的对照组小鼠(即OVA i.c.)在前房注射OVA后的第3、7天分别被处死；正常对照组小鼠(normal)未接受任何处理，直接被处死。获取各组小鼠脾脏，采用流式细胞学方法，用抗CD3、抗CD4和抗Tim-3单克隆抗体进行细胞表面染色，检测脾细胞中CD4<+>Tim-3<+>T细胞的阳性表达率，同时以CD25分子作为活化T细胞的表面标志，评价CD4<+>Tim-3<+>T细胞的活化状态。 结果：在实验组小鼠(i.c.+s.c.)的脾脏中，CD4<+>Tim-3<+>T细胞的阳性表达率呈动态改变：脾脏CD4<+>Tim-3<+>T细胞的表达率在前房注射OVA后的day 3亚组中明显增高，与阳性对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)；而在前房注射OVA后的day 7、14亚组中逐渐降低，与阳性对照组相比，差异无统计学意义(P>0.05)；在前房注射OVA后的dav 28亚组中下降至正常对照组的水平(P>0.05)。在实验组的各个时间点小鼠的脾脏中，CD4<+>CD25<+>Tim-3<+>T细胞阳性率的变化趋势与CD4<+>Tim-3<+>T细胞阳性率的变化趋势相一致；而实验组的各个时间点小鼠的脾脏中，CD4<+>CD25<->Tim-3<+>T细胞的阳性率较恒定，且与阳性对照组相比无统计学意义(P>0.05)。在前房注射OVA对照组(OVA i.c.)的脾细胞中，CD4<+>Tim-3<+>T细胞的阳性表达率以及CD4<+>CD25<+>T细胞的阳性率均与正常对照组的阳性率结果相似。 结论：脾脏CD4<+>T细胞的Tim-3蛋白表达在ACAID的形成过程中呈动态变化，其动态改变主要发生在活化的CD4<+>Tim-3<+>T细胞亚群；CD4<+>CD25<+>Tim-3<+>T细胞阳性率在前房注射OVA后的day 3亚组中明显升高，早于ACAID的形成时间，提示Tim-3可能参与了ACAID的形成。