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巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)作为目前应用最为广泛的真核微生物表达宿主细胞之一,与其它表达系统相比,P.pastoris表达系统最显著的优势在其具有严格受甲醇诱导的诱导型强启动子-启动醇氧化酶1(alcohol oxidase 1,AOX1)启动子(promoter of alcohol oxidase 1,PAOX1),研究发现,该启动子只有在甲醇作为唯一碳源时才发挥功能,当甘油或葡萄糖等碳源存在时,PAOX1受到严重抑制。通过对其诱导机制研究发现,甲醇代谢调控因子1(methanol expression regulator 1,MXR1)是PAOX1发挥启动功能所必须的。目前关于MXR1如何调控PAOX1的机制研究尚不是很清楚,本文通过研究MXR1激活AOX1转录机理,揭示甲醇诱导,甘油阻遏AOX1转录机理。首先通过PULL-DOWN找到与P.pastoris MXR1相互作用的一个蛋白—酪氨酸磷酸酶(Protein phosphotyrosine phosphatase,PTP)。该蛋白在甲醇培养基中与MXR1相互作用,并通过体外实验验证其功能是去磷酸化,可以水解磷酸化的MXR1第215丝氨酸的磷酸基团。将PTP高低表达后,分别提取甘油,甲醇培养基的野生型,高表达和敲除菌株的总蛋白,用MXR1S215位特定位点磷酸化抗体Western blot检测MXR1在不同培养基磷酸化情况和在甲醇培养基中甲醇消耗量。发现野生菌株MXR1在甲醇培养基磷酸化水平远远高于其在甘油培养基中磷酸化水平。PTP高表达时,无论在甘油还是甲醇培养基中MXR1都没有发生磷酸化,而PTP敲除菌株MXR1蛋白磷酸化水平明显高于野生型菌株,说明磷酸酶PTP调控MXR1磷酸化修饰。检测PTP高低表达突变体后对甲醇代谢影响,发现PTP高表达菌株,甲醇代谢受到抑制,AOX1转录水平几乎为零,同时检测不到AOX1酶活,说明PTP的高表达抑制了AOX1的转录,从而抑制了在以甲醇为唯一碳源培养时甲醇的代谢。进一步研究MXR1第215位丝氨酸磷酸化修饰对甲醇代谢的影响,运用CRISPR/Cas9基因编辑系统在P.pastoris基因组上成功将MXR1第215位丝氨酸定点突变成丙氨酸。在甲醇培养基中,应用荧光定量PCR方法检测了野生型,定点突变后和敲除菌株的与甲醇代谢相关基因的表达量,通过荧光定量PCR检测几种MXR1靶向基因AOX1、AOX2、DAS1、DAS2在含甲醇培养基诱导后的表达水平。MXR1基因缺失导致AOX1、DAS1、DAS2的转录水平显著下降。在MXR1S215A突变体中,AOX1、AOX2、DAS1、DAS2的转录也减少近50%。上述结果表明,AOX1、DAS1、DAS2的转录受MXR1调控,而MXR1第215位丝氨酸磷酸化修饰对该功能并不十分重要。以上说明PTP调控MXR1第215位丝氨酸磷酸化修饰,调控甲醇代谢通路,但是当磷酸酶PTP高表达时,甲醇代谢受到抑制不仅受MXR1第215位丝氨酸磷酸化修饰调控,可能还与其它调控相关。