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胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1，IGF-1)是一广谱促生长因子，其化学结构与胰岛素原类似，由70个氨基酸组成。它通过与IGF-1受体(IGF-IR)结合发挥生理作用，并受IGF结合蛋白(IGFBP)调控。
基因重组人IGF-1(rhIGF-1)的临床试验已经在一系列的疾病上展开，比较认可的临床适应症包括Laron侏儒综合征、胰岛素对抗糖尿病、肾功能不全、肌萎缩侧索硬化和多发性硬化症。大量实验证实IGF-1可调节神经细胞的生长、发育和分化，抑制多种因素导致的神经细胞凋亡，其抑制凋亡的机制主要涉及抗凋亡基因的激活等方面。正在进行的临床前研究提示其在神经系统方面也会有广阔的应用前景。目前国外有美国Insmed公司和Tercica公司上市了rhIGF-1。产品均采用基因工程大肠杆菌生产。
我国在rhIGF-1的开发上显然处于落后的位置，因此有必要加紧产品研发。本研究首先应用基因工程技术，构建了在新型的原核表达载体，在大肠杆菌表达了该蛋白，然后我们摸索了比较理想的中试发酵工艺，并对纯化方法进行了比较系统的研究，使纯化工艺适合工业化生产。研究内容主要包括以下三个部分：
一、IGF-1表达载体的构建
国内有许多单位报道了用大肠杆菌表达IGF-1的研究，但都没有获得天然结构的IGF-1。国外虽然有最终产物为天然结构的IGF-1的研究报道，但纯化方法繁琐。为此我们设计了设计了新型表达载体。根据人IGF-1基因的核苷酸序列设计并合成引物，以聚合酶反应(PCR)扩增IGF-1基因；将PCR产物插入表达质粒pET32的多克隆位点，得到的重组质粒编码硫氧还蛋白和人IGF-1分子的融合蛋白。我们构建的载体在融合蛋白的连接处引入了羟胺裂解位点，方便后期的加工。同时载体含有6×组氨酸标签，简化了表达蛋白的纯化步骤。以表达质粒转染大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素抗性筛选，获得序列距确的克隆。以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导，工程菌可表达分子量约28 kD的重组蛋白，与目的蛋白分子量相似。重组蛋白主要以包涵体形式存在。Western blot分析证明，融合蛋白具有人IGF-1的抗原性。
二、工程菌表达条件的优化及高密度发酵工艺的初步探索
作为中试工艺的初探，我们对表达重组IGF-1的E.coli DH5α工程菌的摇瓶小试发酵条件进行研究。利用单因素法比较时间、诱导剂浓度等因素对工程菌IGF-1融合蛋白表达的影响。研究表明，对诱导剂IPTG，浓度可降低到0.125mM仍可获得较好的表达效果；3种培养基中LB的产率略高；最佳诱导时间为5小时。优化后的表达条件可以明显减少诱导剂IPTG的用量。
为了新药临床前研究打下基础，我们在摇瓶小试发酵的基础上进行中试规模的发酵研究。在5升的发酵灌上对高密度发酵的参数进行初步的探索结果表明，在添加微量元素后菌体的密度可以提高1倍。在30-60％的氧溶下工程菌的密度进一步提高了4倍，明显提高了发酵效率。由于IPTG价格昂贵，且有一定的毒性，我们还对乳糖的诱导效果进行了观察，发现0.2％乳糖也可达到很好的诱导效果，从而可以替代IPTG。因此我们建立的中试发酵条件具有较高的效率。
三、rhIGF-1的纯化工艺和对神经细胞的保护作用研究
建立一个方便、价廉的纯化方法是开发基因工程蛋白产品的关键之一。文献报道采用IgG为亲和介质的纯化方法虽然特异性高，但价格高。鉴此我们在构建表达载体时引入了6×组氨酸纯化标签，对融合蛋白采用金属亲和层析法进行纯化。纯化的融合蛋白经羟胺裂解后再次进行金属亲和层析法纯化。结果表明采用该工艺可以得到高纯度的融合蛋白和目的蛋白。释放的蛋白经飞行质谱鉴定，蛋白质分子量符合理论值。对纯化的蛋白进行复性后采用MTT法测定其对神经瘤母细胞瘤细胞的保护作用。结果表明，纯化的蛋白可以抑制冈田酸对神经母细胞瘤细胞的毒性。该结果支持了IGF-1用于阿尔兹海默病治疗的设想。
为了使制备工艺更适合工业化生产，我们采用国产Co-NTA色谱填料对融合蛋白进行纯化，结果和进口Ni-NTA色谱填料相似，而价格只有后者的十分之一。进一步的研究发现蔗糖渗透压休克处理可以提高纯化的效率。因此我们建立的纯化工艺非常适合工业化生产。
综上所述，本研究表明我们建立的人IGF-1原核表达载体能高效表达融合蛋白，获得的目的蛋白具有很好的活性。采用乳糖诱导避免了传统的IPTG诱导剂的毒性并减少了成本。此外采用羟胺裂解的思路建立的IGF-1表达载体非常适合工业化生产。在下游的纯化工艺中证明国产Co-NTA色谱填料可以和进口的Ni-NTA色谱填料媲美。在纯化前对细菌增加简单的蔗糖渗透压休克处理可以进一步提高纯化效率。
结论：本研究成功构建了表达人IGF-1的工程菌，并实现了中试规模的发酵、表达。同时我们摸索了一套适合工业化的比较经济的诱导、分离纯化等制备工艺，基本满足了新药临床前研究对制备工艺的要求。