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目的:(1)探讨白藜芦醇(Resveratrol,Res.)治疗结肠炎及肠炎相关肠癌的作用与miR-31-5p的关系。(2)人hsa-miR-31-5p与小鼠mmu-miR-31同源同序列。使用过表达mi R-31的转基因小鼠造成DSS(葡聚糖硫酸钠,Dextran Sulfate Sodium)肠炎模型,观察miR-31在溃疡性结肠炎发生发展中的作用。方法:(1)HCT 116细胞系分为6组:control组,24 h白藜芦醇组,miR-31-5p mimic组,miR-31-5p mimic加24 h给药组,mi R-31-5p inhibitor组,miR-31-5p inhibitor加24 h给药组。后四组使用脂质体瞬时转染miR-31-5p mimic和miR-31-5p inhibitor至HCT 116细胞中,其中加药组再给予终浓度为10μg/mL的白藜芦醇孵育细胞。使用qRT-PCR技术验证miR-31-5p mimic和inhibitor的瞬时转染效率。miR-31-5p mimic的作用主要是过表达miR-31-5p而miR-31-5p inhibitor的作用主要是敲低miR-31-5p。(2)运用克隆集落实验,检测各组细胞在培养14天后的细胞集落形成的数目、集落大小以此判断白藜芦醇对HCT 116细胞增殖能力的影响;细胞划痕实验检测各组细胞在划痕后24小时划痕的愈合能力以判断白藜芦醇对细胞迁移能力的影响;运用新型细胞计数仪器Cytation5细胞成像微孔板检测仪动态监测control组和24 h白藜芦醇组细胞长达16小时的细胞增殖和分裂情况,进一步证实白藜芦醇对各组细胞增殖能力的影响。(3)利用流式细胞术检测各组HCT 116细胞的凋亡情况和细胞周期,观察白藜芦醇对各组细胞的凋亡和细胞周期的影响。(4)使用Targetscan,miRWalk等miRNA靶点预测网站和测序结果预测miR-31-5p的潜在mRNA靶点。qRT-PCR观察control组,miR-31-5p mimic组,miR-31-5p mimic加24 h给药组及miR-31-5p inhibitor组中miR-31-5p可能的作用靶点。(5)Western Blot法检测六组细胞中NF-κB,ERK1/2,Bcl-2和Bax蛋白的表达。(6)30只FVB小鼠随机分为4组,正常对照组,正常+DSS组,miR-31过表达对照组,miR-31过表达+DSS组。其中人hsa-miR-31-5p与FVB小鼠mmu-miR-31同源同序列。利用1%DSS诱导FVB小鼠结肠炎观察mi R-31在肠炎中的作用。造模周期为1%DSS给予2个半cycle,每两天称重并每天观察炎症体征血便和小鼠活动状态,实验结束后留取结肠组织福尔马林固定、石蜡包埋进行H&E染色观察肠炎情况。结果:(1)我们的前期实验中利用利用基因芯片技术测定溃疡性结肠炎病人肠炎组织差异性表达的miRNA、选定有差异性表达而且目前研究较少的hsa-miR-31-5p作为我们的研究对象。此外动物实验H&E染色结果表明miR-31过表达小鼠DSS诱发肠炎明显,比正常对照组小鼠严重。HE染色镜下可看到炎症细胞浸润明显,病变可至粘膜层、肌层甚至达浆膜层,隐窝大部分破坏且变形,排列紊乱。结合上述结果我们将miR-31-5p列为研究靶点。(2)qRT-PCR结果证明白藜芦醇可以时间依赖性下调HCT 116细胞中miR-31-5p的表达。HCT 116细胞转染miR-31-5p mimic和mi R-31-5p inhibitor后,miR-31-5p的表达前者增加了约80倍(P<0.01),后者降低了约1倍(P<0.01),证明转染有效。(3)划痕实验和克隆集落实验结果证明白藜芦醇可以减少HCT 116细胞的克隆集落数量以及抑制其迁移,且转染miR-31-5p mimic和inhibitor后,转染miR-31-5p mimic组细胞迁移面积增加(P<0.01)、克隆集落数量增加(P<0.01),转染miR-31-5p mimic给予白藜芦醇组相比于miR-31-5p mimic组迁移面积减少(P<0.01)、克隆集落数减少(P<0.01);miR-31-5p inhibitor组给予白藜芦醇后,迁移面积(P<0.01)和克隆集落数比control组减少(P<0.01)。(4)流式细胞结果证明,白藜芦醇可促进HCT 116细胞凋亡(P<0.01),且使其细胞周期阻滞在G2期。miR-31-5p mimic组细胞凋亡率与control组无显著差异,但是白藜芦醇处理后细胞凋亡增加(P<0.01);mi R-31-5p inhibitor组凋亡率显著高于control组(P<0.05),且给白藜芦醇后凋亡增加明显(P<0.01)。细胞周期结果显示过表达miR-31-5p后,HCT 116细胞在S期的比例增加,给白藜芦醇后,S期比例减少;敲低miR-31-5p后,细胞周期比例无明显变化,但是给予白藜芦醇后细胞周期S期比例增加。(5)qRT-PCR结果证明当过表达miR-31-5p时,SATB2基因表达量比control组降低(P<0.05),白藜芦醇处理后SATB2基因表达量增加(P<0.05),敲低miR-31-5p后其表达量高于miR-31-5p mimic组(P<0.01);敲低miR-31-5p的表达后PPP2R2A的表达量相比于control组上调(P<0.05)。(6)白藜芦醇可抑制NF-κB的表达(P<0.05),与control组相比,过表达miR-31-5p时,NF-κB表达升高(P<0.05),给予白藜芦醇后NF-κB表达比miR-31-5p mimic组下降(P<0.05);当敲低mi R-31-5p并且给予白藜芦醇时,NF-κB表达低于control组(P<0.01)。此外,白藜芦醇还可下调Bcl-2和Bax的蛋白表达比值(P<0.05),当过表达miR-31-5p时,Bcl-2和Bax比值高于control组(P<0.05),当再次给白藜芦醇后Bcl-2和Bax比值减小(P<0.01)但仍高于单独给与白藜芦醇组;当敲低miR-31-5p并且给予白藜芦醇时,Bcl-2和Bax比值相对于control组下降(P<0.05)。各组ERK1/2蛋白表达无明显变化。结论:白藜芦醇对HCT 116细胞的抗增殖和促凋亡作用与靶向抑制miR-31-5p的表达有关。miR-31过表达可加重DSS诱导的溃疡性结肠炎的发生。