研究背景：目前抑郁症已成为威胁人类健康的严重疾患,据世界卫生组织统计,在全世界范围内已有三亿五千万名抑郁症患者。然而目前,抑郁症的治疗和预后仍然不容乐观,其中主要原因是由于抑郁症的病因学机制尚不清楚,抗抑郁药疗效局限性等因素有关。因此,深入明确抑郁症发病机制,完善并提高抗抑郁疗效对攻克抑郁症尤为重要。应激刺激被认为是引起人群中抑郁症发病的重要危险因素,并介导抑郁症病情发展。在动物行为学研究中也显示,应激刺激可使动物产生类抑郁样的行为异常,故此应激刺激也被广泛用于建立高信度抑郁症动物模型,对抑郁症病因学,及抗抑郁药药理学研究起着支撑性的作用。更值得注意的是,虽然绝大多数个体对于应激刺激是敏感的,然而,仍有部分经受应激刺激的个体却并没有造成抑郁症的发病,而呈现出对于应激有着类似抵抗作用的表型。对于此类表型的研究对探明抑郁症的发病有重要意义,然而目前对于此类研究仍然很少。抗抑郁药疗效的局限性是抑郁症的另一个重大挑战,临床上药物治疗无效的个体普遍存在。5羟色胺再摄取抑制剂(SSRI)是广泛应用于临床的抗抑郁药,而临床上仍有近40%的患者在使用抗抑郁剂治疗后,无法临床缓解,而表现为对治疗的抵抗。另外,在抗抑郁剂治疗的应激模型中也存在治疗抵抗的表型。而研究药物治疗抵抗的机制对于阐明抗抑郁剂的作用机制,指导提高改善抗抑郁剂疗效有着重要的作用,然而对于药物治疗抵抗的研究目前鲜有报道。由于医学伦理道德要求和技术手段局限性,针对患者深入机制研究受到限制,故此构建理想的动物模型是进一步深入研究抑郁症发病发展及治疗机制的关键,这也是本研究力求解决的问题之一。慢性不可预见性应激模型提供了独一无二的平台,它能够模拟抑郁症的诸多核心症状,并且,抗抑郁药物治疗也同样可以明显缓解这些“症状”,为同时研究抑郁症的发病及治疗提供了可行性。而本项研究旨在建立慢性不可预见性应激模型的基础上,探讨同时研究建立应激敏感、应激抵抗、氟西汀治疗有效及氟西汀治疗抵抗模型的可行性,从而从应激抵抗及药物抵抗的角度研究抑郁症发病和治疗。海马区是机体介导应激刺激的重要区域。当应激刺激暴露后,海马区接受外界应激刺激信号或其他脑区输入信号,其神经元会做出相应可塑性调节调整,以达到适应环境,应对应激刺激的目的,这种神经元可塑性调节与抑郁症的发病机制和药物作用作用机制密切相关。大量研究显示,抑郁症患者其海马体积较正常人群的海马体积显著减小,并且体积的减小程度与患者病程长短呈负相关[14-16]。进一步研究显示,应激可导致海马神经元可塑性结构的异常,如细胞发生减少、神经胶质原减少、体积萎缩、树突萎缩和树突棘减少等[17-19]。而在应激抵抗个体树突及树突棘变化却正好相反。更重要的是,抗抑郁剂的治疗会逆转抑郁症发病时海马树突棘的减少,这种树突棘的增加是抗抑郁剂发挥作用的必要条件。可见,海马神经元树突及树突棘可塑性调节的异常是导致抑郁发生的重要原因,并且参与了抗抑郁药的药效机制。许多研究已经证明,Eph家族蛋白是调节树突、树突棘形态发生的重要蛋白分子。在Eph受体失活时,海马神经元的树突棘始终停滞在无末端膨大的发育初期形态,而在Eph蛋白基因敲除的小鼠中,其树突棘同样处于未成熟状态且密度明显减小[25-27]。另外,Eph对学习与记忆过程也有重要作用[27-29],Eph敲除小鼠的海马切片中,蛋白合成依赖的长时程增强信号受损。而行为学研究显示,ephrin配体基因敲除小鼠也会出海马依赖的惊恐记忆行为损伤,同样当注入Eph受体拮抗剂到海马区后小鼠T型迷宫空间自主交替能力受损,相反注入Eph受体激活剂后其学习记忆又能够得到改善。再次,对于精神疾病的遗传位点研究显示,许多Eph和ephrin基因的定位与染色体上的精神疾病敏感的区域相近,如精神分裂症与双相障碍。Eph家族蛋白的生物功能研究高度提示了Eph家族蛋白可能也参与了应激所致抑郁中的神经可塑性调控或抗抑郁药药理过程。然而,目前针对Eph家族蛋白在抑郁症发病及药效机制中的相关研究还鲜有报道。目的：在慢性不可预见性温和抑郁动物模型(CUMS)的平台上,以氟西汀为代表的5羟色胺再摄取抑制剂为治疗药物,同时建立应激敏感、应激抵抗、氟西汀治疗有效及氟西汀治疗抵抗模型,在同一模型平台上,共同研究应激导致抑郁症发病及其治疗的不同方面,并在此基础上,探讨Eph家族蛋白在应激敏感、应激抵抗、氟西汀治疗有效及治疗抵抗模型中的表达变化。方法：(1)大鼠蔗糖消耗训练及基线水平测定：应激刺激开始前5周中,第1至3周每周两次进行蔗糖消耗实验,第4至第5周每周一次进行蔗糖消耗实验,选取最后4次的蔗糖消耗水平的评价值做为基线水平。(2)21天持续应激刺激：连续21天,每天不同的温和应激刺激大鼠,建立CUMS抑郁动物模型。对照组不给于应激刺激。(3)应激敏感及应激抵抗组的筛选：21天持续应激结束时测定大鼠蔗糖消耗水平,定义蔗糖消耗水平下降量为>25%的大鼠为应激敏感大鼠(CUMS组),定义蔗糖消耗水平下降量<10%的大鼠为应激抵抗大鼠(CUMS-Res组)。(4)随机选取部分应激敏感大鼠接受28天持续氟西汀(10mg/kg)或盐水(CUMS-V组)腹腔注射并同时给予应激刺激暴露。(5)氟西汀治疗有效及治疗抵抗组筛选：第28天氟西汀给药末测量蔗糖消耗水平,定义蔗糖水平增加量>20%的大鼠为氟西汀治疗有效大鼠(CUMS-Flx组),定义蔗糖水平增加量<10%的大鼠为氟西汀治疗抵抗大鼠(CUMS-Flx-Res组)。(6)在慢性应激刺激开始前,21天持续应激结束后及氟西汀治疗结束后分别测量大鼠体重及旷场行为,进一步评估类抑郁样行为。(7)麻醉大鼠,解剖获取海马组织,纯化组织总蛋白,测定浓度,使用蛋白免疫印迹技术测定EphA4受体及ephrin3配体在各组中的蛋白表达。结果：(1)21天慢性应激刺激后,对照组,CUMS组及CUMS-Res组除蔗糖消耗水平出现显著性差异外,各组中体重、总运动路程、平均运动速度均存在显著性差异(P<0.01)。在21天慢性应激刺激后,CUMS组较对照组和CUMS-Res组的蔗糖消耗水平、体重、总运动路程及平均运动速度显著下降(P<0.01)。而CUMS-Res组大鼠其蔗糖消耗水平、体重、总运动路程和平均运动速度较对照组无统计学差异。(2)28天氟西汀给药治疗后,对照组、CUMS-V组、CUMS-Flx组及CUMS-Flx-Res组的蔗糖消耗水平存在显著差异(P<0.01)。CUMS-Flx组较CUMS-V组蔗糖消耗显著提高(P<0.01). CUMS-Flx组用药后体重、总运动路程、平均运动速度较CUMS-V组显著改善(P<0.01)。而CUMS-Flx-Res组在接受28天氟西汀治疗后,其蔗糖消耗较CUMS-Flx组无显著提高,且其体重、总运动路程、平均运动速度未得到恢复。(3)蛋白免疫印迹分析显示,EphA4受体和ephrinA3配体蛋白分子在对照组、CUMS组与CUMS-Res组存在显著差异(P<0.01), CUMS组中EphA4较对照组显著下降(P<0.01),而ephrinA3较对照组显著上调(P<0.01)。而在CUMS-Res组中,EphA4和ephrinA3蛋白分子较对照组没有变化。经28天氟西汀治疗后,氟西汀导致CUMS-Flx组的EphA4蛋白分子的表达水平上调,并与对照组的表达水平持平；而ephrinA3蛋白分子在氟西汀用药后出现下调,并与下调至对照组水平。CUMS-Flx-Res组中EphA4和ephrinA3蛋白分子的表达失调较前无明显变化,并与CUMS-Flx组中EphA4和ephrinA3蛋白分子的表达存在显著差异(P<0.01)。结论：在慢性不可预见性应激模型的基础上,我们成功建立了应激敏感、应激抵抗、氟西汀治疗有效及氟西汀治疗抵抗动物,在同一模型平台上,共同研究应激导致抑郁症发病及其治疗的不同方面。应激敏感个体存在严重的快感缺失、空间运动能力及体重的下降,同时伴随着酪氨酸激酶受体家族蛋白中EphA4及ephrinA3的表达失调。而应激抵抗大鼠能够适应应激刺激,维持快感反应、空间运动能力及体重指标的正常,同时抵御EphA4受体及ephrinA3配体蛋白表达的失调。另外,氟西汀治疗逆转氟西汀敏感组快感缺失、其空间运动能力及体重的下降的同时,也恢复了EphA4受体及ephrinA3配体的失调；而氟西汀治疗无法恢复氟西汀治疗抵抗组中个指标的失调。EphA4及ephrinA3蛋白可能参与了机体应对应激刺激的调控过程,同时也可能参与了氟西汀治疗慢性不可预见性应激所致抑郁样行为的药物起效过程。