[研究背景及目的]变应性鼻炎(Allergic Rhinitis, AR)在发展中国家和欧美地区的流行情况非常严重,我国亦是变应性鼻炎高发地区,人群患病率约10%。临床上缺乏特异而有效的治疗靶点和干预手段。变应性鼻炎是由于机体在外界环境的诱导下导致的以鼻黏膜局部以TH2反应为主要特征的病理改变。在其病理过程中有大量的细胞因子和细胞的参与。基因芯片结果显示Clara细胞10KDa蛋白(CC10蛋白)为变应性鼻炎患者鼻黏膜中下调最明显的蛋白。CC10蛋白为新近认识的子宫珠蛋白超家族主要成员之一。它主要表达于与外界相通的上皮,包括支气管上皮和鼻粘膜上皮等。CCl0蛋白具有抗炎和免疫调节作用。既往研究显示它可以拮抗分泌性磷脂酸A2的活性,降低炎性细胞趋化,下调TH2细胞的分化,并且可以阻断前列腺素D2受体介导的NF-κB活性。我们以前的研究显示CC10基因敲除小鼠在抗原刺激下,也是产生过度的以TH2细胞反应为主的嗜酸性粒细胞炎症,并且CC10蛋白可以直接抑制TH2细胞因子的产生。辅助性T细胞17(TH17)细胞是最近几年发现的一种新型的辅助性T细胞。TH17细胞的发现源于对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE),以及对胶诱导的关节炎(CIA)的研究。传统上认为,上述两种自身免疫病是由TH1细胞介导的。然而研究发现：清除或中和TH1型细胞因子IFN-γ或IL-12的功能,并不能预防或减轻疾病的进程。而清除IL-23的功能则延缓了疾病的进程。进一步发现,缺失IL-17+T细胞可以使EAE等自身免疫病的发病受到抑制,认识到是IL-17+T细胞而不是经典的TH1细胞在此环境中诱导自身免疫病。TH17细胞分泌的细胞因子除了IL-17(IL-17A)外,还包括IL-17F,以及IL-21、IL-22、IL-6、TNF-α等细胞因子。不同的T细胞亚群也有相对特异性的标记物,主要是它们的转录调控因子的不同。如TH1细胞为T-bet, TH2细胞为GATA-3,Tregs为FoxP3,目前证实TH17细胞的特异性转录调控因子为ROR-γt。TH17细胞在发现早期就已被证实与自身免疫病有着非常密切的关系。在各种自身免疫病,包括系统性红斑狼疮(SLE)以及肿瘤中都证实TH17能促进疾病的发生和发展。新近研究发现哮喘患者以及变应性鼻炎患者外周血中IL-17的含量是增高的,并且证实了在哮喘小鼠模型中TH17细胞是促进TH2细胞引起的嗜酸性粒细胞炎症。鉴于CC10蛋白对辅助性T细胞的作用以及TH17细胞在变应性呼吸道疾病中的作用,我们建立变应性鼻炎小鼠模型,探讨变应性鼻炎模型中CC10蛋白对TH17细胞的作用,为变应性疾病治疗开发CC10蛋白药物提供理论基础。具体研究目标如下：1.建立变应性性鼻炎模型①在疾病进程中动态观察鼻黏膜局部CC10蛋白与TH17细胞反应的关系。②研究CC10基因敲除变应性鼻炎小鼠模型中鼻黏膜局部TH17细胞反应的情况。③研究体内给予CC10蛋白对TH17细胞反应的影响。④研究CC10蛋白对TH17细胞反应的细胞机制和分子机制。[研究方法]1.采用卵清白蛋白皮下注射致敏并通过鼻腔进行激发建立野生型和CC10基因敲除变应性鼻炎小鼠模型,在疾病进程中对小鼠鼻黏膜组织行HE染色和PAS染色观察其病理改变,免疫组化方法检测鼻黏膜局部CC10蛋白表达情况。并通过Real-time PCR和ELISA方法检测TH1,TH2以及TH17细胞反应的相关的细胞因子水平。流式细胞术检测鼻黏膜局部TH17和TH2细胞反应情况。2.在CC10基因敲除变应性鼻炎小鼠模型致敏阶段腹腔给予CC10蛋白,小鼠鼻黏膜组织行HE染色和PAS染色观察其病理改变,并通过Real-time PCR和ELISA方法检测TH1,TH2以及TH17细胞反应的相关的细胞因子水平。流式细胞术检测腹部沟淋巴结以及鼻黏膜局部TH17和TH2细胞反应情况。3.在野生型变应性鼻炎小鼠模型激发阶段鼻腔给予CC10蛋白,小鼠鼻黏膜组织行HE染色和PAS染色观察其病理改变,并通过Real-time PCR和ELISA方法检测TH1,TH2以及TH17细胞反应的相关的细胞因子水平。流式细胞术检测鼻黏膜局部TH17和TH2细胞反应情况。4.分离野生型小鼠脾脏树突状细胞,体外给予CC10蛋白和卵清白蛋白进行刺激,ELISA方法检测培养的树突状细胞上清中IL-6, TGF-β以及IL-23的量。5.体外给予CC10蛋白作用后的树突状细胞和卵清白蛋白体内致敏后的T细胞进行作用,胞内因子染色检测TH17细胞的情况。6荧光双染检测CC10基因敲除小鼠和野生型小鼠变应性鼻炎模型小鼠脾脏中树突状细胞分泌IL-6, TGF-β以及IL-23的情况。7免疫组化方法检测CC10基因敲除小鼠和野生型小鼠变应性鼻炎模型中鼻黏膜局部上皮表达CCL20情况。体外培养BEAS-2B细胞,给予TH1,TH2,TH17细胞因子以及前炎细胞因子进行刺激,然后给予CC10蛋白进行处理,检测CC10蛋白对细胞因子引起的上皮细胞表达CCL20的作用。[实验结果]1.在野生型变应性鼻炎小鼠模型中,鼻粘膜上皮中CC10阳性细胞数目随着激发次数的增加,呈现逐渐下降的趋势。在激发前,鼻粘膜上皮中的CC10阳性细胞数目为100±2个／mm,在激发1天后,鼻粘膜上皮中的CC10阳性细胞数目为90±3个／mm,而在激发第3天和第5天以后,鼻粘膜上皮中的CC10阳性细胞数目分别为80±6个／mm和50±4个／mm,与生理盐水组相比,有显著统计学差别(p<0.05)。2.在野生型变应性鼻炎小鼠模型中,鼻粘膜局部TH17细胞相关分子如RORγt,IL-17A,IL-17F和IL-22mRNA表达水平分别比生理盐水对照组增加了3倍(p<0.05),4倍(p<0.01),5倍(p<0.05)和7倍(p<0.05)。而小鼠鼻腔灌洗液中的IL-17A的蛋白水平随着激发次数的增加,也呈现逐渐增加的趋势,其在第14天为200±2pg/ml和第15天为200±10pg/ml,与对照组相比,没有统计学差别；而在第17天为400±7pg/ml,第19天为1600±11pg/ml,与对照组相比,有明显统计学差别,分别为p<0.05和p<0.01。而在鼻腔灌洗液中,分泌IL-17的细胞主要为TH17细胞(CD4+IL-17+),所占比例为11.1%,与生理盐水组有明显统计学差别(p<0.05)。3.在CC10基因敲除变应性鼻炎小鼠模型中,鼻腔灌洗液中的细胞计数显示lml灌洗液中其总炎性细胞个数为1.75×106个,嗜酸性粒细胞数(0.9×106个／ml)和淋巴细胞计数(0.7×106个／ml),与对照组相比,有明显统计学差别。鼻粘膜局部IL-4,IL-5,IL-13的mRNA水平相对于野生型对照组有明显统计学差别(p<0.05),而IFN-Y的mRNA表达没有统计学差别。而在鼻腔灌洗液中,TH17细胞(CD4+IL-17+),所占比例为27.2%,与野生型对照组相比有明显统计学差别(p<0.05)。4.CCl0基因敲除变应性鼻炎小鼠模型中,分别在第0天和第7天致敏小鼠,于第14天处死小鼠,分离腹股沟淋巴结并分离其单个核细胞,流式细胞术显示TH2细胞比例为20.3%,TH17细胞比例为17.9%,与野生型小鼠相比,有明显统计学差别(p<0.05),而TH1细胞在两组之间没有统计学差别。5.在致敏阶段给予CC10基因敲除小鼠CC10蛋白,抗原激发后鼻粘膜上皮中的杯状细胞数目,鼻腔灌洗液中的总炎性细胞,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数目相对于生理盐水对照组,都有显著性统计学差别。鼻粘膜局部IL-4,IL-5,IL-13的mRNA水平相对于野生型对照组有明显统计学差别(p<0.05),而IFN-γ的mRNA水平没有统计学差别。在鼻腔灌洗液中,TH17细胞(CD4+IL-17+)所占比例为20.2%,与生理盐水对照组(5.3%)相比有明显统计学差别。6.磁珠分选野生型未致敏小鼠脾脏中的T淋巴细胞,体外给予IL-4的中和抗体,IFN-Y的中和抗体,TGF-β,IL-6,IL-23细胞因子以及抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体使T细胞向TH17细胞分化,然后加入CC10蛋白,结果显示IL-4中和抗体,IFN-γ的中和抗体,TGF-β,IL-6和IL-23以及抗CD3单克隆抗体和抗CD28单克隆抗体联合使用明显使T细胞向TH17细胞分化,但是CC10蛋白不能抑制此作用。7.分别在第0天和第7天致敏小鼠,于第14天处死小鼠,分离小鼠脾脏组织,其组织切片行免疫双染显示在CC10基因敲除小鼠中树突状细胞分泌的TGF-β, IL-6和IL-23的水平显著高于野生型小鼠。8.磁珠分选野生型致敏小鼠的脾脏中的CD11C+树突状细胞,体外给予CC10蛋白和卵清白蛋白进行刺激,24小时后用ELISA方法检测上清中的TGF-β和IL-6的水平,与为给予CC10蛋白相比,加入CC10蛋白后,TGF-β和IL-6的水平是显著降低的,并且树突状细胞中的IL-23p19的mRNA水平也显著降低。9.卵清白蛋白致敏后的野生型小鼠中,将体外脾脏分离的树突状细胞用CC10蛋白处理后与卵清白蛋白致敏后的野生型小鼠脾脏分离T淋巴细胞进行混合培养,培养48小时后,流式细胞仪技术胞内细胞因子方法检测TH17细胞的比例,发现CC10蛋白处理后其比例为7.6%,而不予处理时为20.1%。10.在激发阶段给予野生型小鼠CC10蛋白,抗原激发后鼻粘膜上皮中的杯状细胞数目,鼻腔灌洗液中的总炎性细胞,嗜酸性粒细胞和淋巴细胞数目相对于生理盐水对照组,都有显著性统计学差别。鼻粘膜局部IL-4,IL-5,IL-13的mRNA水平相对于野生型对照组有明显统计学差别(p<0.05),而IFN-γ的mRNA表达没有统计学差别。在鼻腔灌洗液中,TH17细胞(CD4+IL-17+)所占比例为12%,与生理盐水对照组(5.3%)相比有明显统计学差别。11.鼻腔灌洗液的细胞滴片中,免疫荧光双染显示CC10基因敲除小鼠中CD11C阳性树突状细胞分泌的IL-23显著高于野生型对照组,并且Real-time PCR结果显示鼻粘膜局部IL-23p19和IL-23P40的mRNA水平显著高于野生型对照组。12.CC10基因敲除变应性鼻炎小鼠模型中,免疫组化显示鼻粘膜局部CCL20蛋白阳性表达细胞的数目显著高于对照组。体外CC10蛋白显著下调BEAS-2B细胞中由于各种细胞因子导致的CCL20的分泌。[结论]1.变应性鼻炎小鼠模型中鼻粘膜局部TH17细胞的数量增多以及其功能增强。2.CC10蛋白通过作用于树突状细胞,调节TH17细胞相关因子的表达来抑制致敏阶段TH17细胞的分化。3.CC10蛋白通过作用于树突状细胞调节其IL-23的分泌来抑制激发阶段TH17细胞的扩增。4.CC10蛋白是通过上皮细胞来调节TH17细胞的局部趋化。