近几年,我国耕地的重金属污染日益严重。如何治理被重金属污染的耕地,以及如何处理、资源化被重金属污染的生物质已经成为我国环境治理的主要课题。植物的根茎部分有很强的重金属富集能力。把木质纤维素生物质通过物理、化学方法进行预处理,然后通过微生物发酵生成生物燃料或材料可以把重金属从食物链中脱离出来。这样既可以变废为宝、减少空气及土壤污染,又可以解决能源问题,是一种非常有潜力的处理方法。但是,目前秸秆的处理主要集中在未被重金属污染秸秆的生物转化,而要探讨秸秆的生物转化在土壤修复中的应用,需研究预处理、糖化对重金属释放的影响、重金属对微生物生长及发酵效率的影响、以及重金属的如何回收与分离。基于此研究背景,本研究以酿酒酵母、树干毕赤酵母和耐镉(Cd²⁺)酵母工程菌为研究对象,着眼于重金属Cd²⁺对酵母生长及乙醇发酵的影响,为探讨秸秆乙醇转化在土壤修复中应用提供一定的理论基础。在本研究中,我们首先评估了Cd²⁺与谷胱甘肽（GSH）合成之间的关系,发现了两者之间的正相关性。通过提高酵母提取物（YE）的添加量可以提高酿酒酵母合成GSH的能力,进而提高了酿酒酵母对Cd²⁺的耐受性。实验发现,即使玉米浆（CSL）和YE都可以减轻Cd²⁺的抑制作用,但是它们在酿酒酵母细胞中GSH的积累过程中发挥着不同的作用。酿酒酵母细胞内GSH随着钙(Ca²⁺)浓度的升高而降低。与氮源相比,高浓度的Ca²⁺能够更有效地提高酿酒酵母对Cd²⁺的耐受性。当Ca²⁺与Cd²⁺的摩尔比为100:1时,酿酒酵母能够耐受的Cd²⁺浓度高达1000μmol/L,且乙醇生产效率无明显下降。因此,使用Ca²⁺来替代高成本的氮源将显著节约成本、提高乙醇转化率。在此基础上,本论文进一步探究了葡萄糖浓度对酿酒酵母的Cd²⁺耐受性及乙醇发酵的影响。在不同葡萄糖浓度下,Cd²⁺的存在都抑制了酿酒酵母细胞生长和乙醇发酵,这一现象在高浓度的葡萄糖条件下更为明显。同样,由于Cd²⁺的胁迫作用,葡萄糖初始浓度对乙醇发酵的抑制作用更为显著。因此,无法通过提高葡萄糖浓度来获得高浓度的乙醇。为提高乙醇浓度,我们探讨了在不同葡萄糖浓度下Ca²⁺对酿酒酵母Cd²⁺耐受性的影响。实验证明即使是在高浓度的葡萄糖条件下,Ca²⁺也能够有效提高酿酒酵母对Cd²⁺的耐受性、乙醇的生产效率及乙醇浓度。对酿酒酵母细胞内的Cd²⁺和GSH测定后发现,在不同葡萄糖浓度下,Ca²⁺的添加都极大地降低了细胞内的Cd²⁺和GSH浓度。综上,我们认为酿酒酵母对Cd²⁺耐受性的提高主要有如下两个机理:a)在没有Ca²⁺存在的情况下,酿酒酵母分泌GSH,螯合Cd²⁺,进而降低Cd²⁺毒性;b)在有Ca²⁺存在的情况下,通过Ca²⁺和Cd²⁺的竞争性转运,降低酿酒酵母吸收Cd²⁺能力,从而减少Cd²⁺对酿酒酵母的抑制性作用。为了考察被污染生物质中半纤维素的乙醇转化的可行性,本论文探讨了Cd²⁺对树干毕赤酵母发酵乙醇的影响。相比较酿酒酵母,Cd²⁺对树干毕赤酵母有更强的抑制作用,且Cd²⁺对木糖代谢的抑制作用要大于对葡萄糖代谢的抑制作用。当有Cd²⁺存在时,木糖还原酶（XR）和木糖醇脱氢酶（XDH）活性都有不同程度的下降。与酿酒酵母相似,Ca²⁺可以提高树干毕赤酵母对Cd²⁺的耐受性及乙醇发酵效率。当Ca²⁺与Cd²⁺的摩尔比为100:1,Cd²⁺浓度在50μmol/L时,树干毕赤酵母的生长及乙醇发酵效率明显提高,葡萄糖和木糖均被完全消耗,最大乙醇浓度是未添加Ca²⁺发酵的1.15倍。然而其最大乙醇浓度只是空白实验(未添加Cd²⁺)的63%。对细胞内的Cd²⁺测定后发现Ca²⁺不能完全限制树干毕赤酵母对Cd²⁺的吸收。相对而言,锰(Mn²⁺)虽然对树干毕赤酵母耐受性提高的作用远远小于Ca²⁺,但是,同时添加Ca²⁺和Mn²⁺却大大提高了乙醇发酵效率,其葡萄糖、木糖消耗率及最大乙醇浓度几乎与空白实验(未添加Cd²⁺)没有差别。对细胞内的Cd²⁺测定后发现,同时添加Ca²⁺和Mn²⁺时,在整个发酵过程中,Cd²⁺在细胞中的浓度保持在极低的水平。这一现象的机制仍然有待进一步研究。最终,本论文探讨了DvCRP1基因在乙醇转化中的应用。DvCRP1基因是诱导Cd²⁺在微生物和植物细胞内积累的Cd²⁺抗性基因。本论文以酿酒酵母为模式微生物,通过响应面法,以微生物生长过程中的OD600值、Cd²⁺浓度、GSH、乙醇浓度、葡萄糖浓度等为影响参数,结合因子分析和回归分析等实验结果统计方法,研究抗Cd²⁺新基因DvCRP1的解毒作用及对酵母生产乙醇的影响。在无DvCRP1转化情况下,Cd²⁺对酿酒酵母的发酵有显著抑制作用,其葡萄糖消耗和乙醇生产分别降低了23%-89%和17%-92%,而在DvCRP1的作用下,其葡萄糖消耗和乙醇生产则分别降低了9%-65%和5%-64%。DvCRP1有效地减轻了Cd²⁺的抑制效果,提高了酵母的对Cd²⁺的解毒作用。且该效果在较高的Cd²⁺浓度和较低的微生物接种浓度时更明显。DvCRP1在Cd²⁺解毒方面起着比微生物接种浓度更重要的作用。微生物接种浓度从0.02增加至0.2,酵母的Cd²⁺解毒上限浓度仅提高了50μmol/L,然而转化DvCRP1的酵母其Cd²⁺解毒可以从150μmol/L增加到300μmol/L。