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食管癌是世界上第八大常见的恶性肿瘤,且位于全球肿瘤死亡率的第六顺位。世界范围内的食管癌发病率和死亡率具有显著的地区性差异。中国北部是食管癌的高发区之一,每年大约有25万的新发病例,占全世界病例数的1/2多。虽然食管癌的治疗方法有所提高,但总体上其五年生存率仍低于30%,而早期食管癌的五年生存率高于90%。因此,目前食管癌研究的重要方向之一即为早诊早治以提高食管癌患者的五年生存率。目前有关食管癌的病理进展有详尽的描述,但其内在的分子机制所知甚少。而分子生物学的发展以及各种实验技术不断的成熟完善（如PCR和免疫组织化染色法等）,在分子水平上为我们研究食管癌提供了良好的条件。Caspase是一类对天冬氨酸特异的半胱氨酸蛋白酶家族,它是与隐杆线虫Ced-3具有序列和结构同源性的一个蛋白家族。目前在哺乳动物细胞中已克隆了14个成员（人类11个,鼠源3个）,Caspase-8基因作为该家族的一员,以酶原形式合成并定位于许多细胞的胞质中,在细胞外（受体介导）途径和细胞内（线粒体依赖）途径的细胞凋亡过程中占据着重要的地位。现已发现Caspase-8在许多肿瘤组织中低表达或不表达,包括神经母细胞瘤、头颈部肿瘤、宫颈癌、膀胱癌、结直肠癌、胃癌以及肺癌等,但Caspase-8与食管癌的关系研究却很少。本课题用定量real-time PCR和免疫组化方法分析Caspase-8基因在食管癌原发灶及其匹配正常食管组织中的mRNA和蛋白表达水平及与临床参数的关系,以探求Caspase-8在食管癌进展中的生物学作用;并且对食管癌患者进行术后随访,分析了Caspase-8基因表达水平对患者预后的影响。材料与方法1.患者组织样本的采集与临床病理资料的收集研究对象为2004年至2007年在郑州大学第一附属医院和林州市肿瘤医院就医的96例食管癌患者（征得同意后）,采集患者术后食管癌原发灶及匹配正常食管组织标本（距离癌灶至少5-6cm）。标本离体后平均分成2份:一份经组织病理学鉴定（HE染色）,另一份术后1h内放入液氮中,后置于-80℃冰箱冷冻保存。并收集患者的性别、年龄、家族史、肿瘤大小、位置、病理分级以及是否有淋巴结转移等临床资料,用于统计学分析。2.样本中Caspase-8 mRNA水平的测定使用荧光定量PCR仪测定食管癌患者癌组织及其匹配的正常食管组织中Caspase-8基因的mRNA表达水平。样本中Caspase-8基因模板的Ct值（循环阈值）即反映模板的含量。3.样本中Caspase-8蛋白水平的测定96例食管癌患者癌组织及其匹配的正常食管组织中Caspase-8的蛋白表达水平使用免疫组织化学染色法测定,在200倍显微镜下观察每一样本的3个染色最强视野,计数阳性细胞数,并计算阳性细胞的百分比,Caspase-8基因蛋白表达水平的指标采用每一个患者的食管癌组织中阳性细胞百分比和正常食管组织中阳性细胞百分比的比值。4.生存分析2008年3月至4月期间,对2004年至2007年在医院就医并采集到标本的食管癌患者进行随访,患者手术治疗时间作为生存的起始时间,随访结束时间作为终点时间,起始时间与终点时间之间的时间间隔定义为患者的生存时间。5.统计学分析采用SPSS12.0软件对数据进行统计学分析,对每一个组织标本,用ΔCt(CtCaspase-8-Ctβ-actin)值表示Caspase-8基因与内参基因β-actin间Ct的差值,Δ（ΔCt）值等于ΔCt（正常食管组织）与ΔCt（食管癌组织）的差值,对Δ（ΔCt）采用独立样本t检验。配对样本t检验用来分析食管癌组织与其匹配正常组织中Caspase-8蛋白表达水平的差异。不同临床参数（如性别、年龄、家族史、肿瘤大小、位置、病理分级及是否有淋巴结转移等）与食管癌样本Caspase-8基因mRNA的表达水平差异比较采用χ2检验,不同临床参数与食管癌样本中Caspase-8蛋白表达水平差异比较采用t检验或方差分析。采用Kappa分析进行Caspase-8 mRNA和蛋白水平的表达一致性检验。绘出Caspase-8基因的表达阳性与阴性的患者Kaplan-Meier生存曲线,使用Log-rank（时序检验）来比较两条曲线的差异。采用Cox回归（比例危险率回归模型）分析临床参数与Caspase-8表达对生存的影响。以α=0.05作为检验水准。结果1.Caspase-8基因在食管癌组织中和匹配正常食管组织中的表达水平96例样本的实时荧光定量PCR结果显示,与匹配正常食管组织相比,Caspase-8在57%（55/96）的食管癌组织中表达下调。单因素分析食管癌组织与匹配正常食管组织中Caspase-8基因mRNA的表达水平,其差异有统计学意义（t=7.307,P=0.000）。配对样本t检验结果显示,Caspase-8蛋白在食管癌组织中表达水平显著低于其匹配正常食管组织（t=-22.761,P=0.000）。Kappa分析表明,Caspase-8基因mRNA和蛋白的表达水平呈现中度一致性（kappa=0.569,P=0.000）。2.Caspase-8基因在食管癌组织中的表达与临床参数之间的关系2.1 Caspase-8基因在食管癌组织中的mRNA表达水平与临床参数之间的关系对临床参数进行单因素分析,Caspase-8的mRNA表达水平与食管癌的淋巴结转移、家族史、肿瘤大小、分期和位置的联系有统计学意义。淋巴结转移组食管癌组织中的表达显著低于淋巴结未转移组（χ2=41.552,P=0.000）,有家族史患者Caspase-8表达水平显著低于无家族史患者（χ2=7.327,P=0.012）,肿瘤体积大的癌组织的Caspase-8表达水平显著低于肿瘤体积小的癌组织（χ2=32.714,P=0.000）,Caspase-8 mRNA在不同病理级别中的表达有统计学意义（χ2=16.816,P=0.000）,食管上段的癌组织Caspase-8的表达显著高于下段癌组织表达水平（χ2=7.887,P=0.019）。相对而言,Caspase-8 mRNA表达水平与其他临床参数如性别和年龄无关。2.2 Caspase-8蛋白在食管癌组织中的表达与临床参数之间的关系单因素分析结果显示,淋巴结转移组癌组织中Caspase-8蛋白表达水平均显著低于淋巴结未转移组（t=5.072,P=0.000）,不同肿瘤大小间Caspase-8蛋白表达水平均具有统计学意义（F=16.534,P=0.000）,肿瘤体积越大,食管癌组织中蛋白表达水平越低。食管癌组织中Ⅰ级和Ⅲ级病理级别间Caspase-8蛋白表达水平有显著性差异（P=0.006）,但Ⅰ级和Ⅱ级,Ⅱ级和Ⅲ级间Caspase-8蛋白表达水平无显著性差异（P=0.308,P=0.070）,而不同病理级别间Caspase-8蛋白表达水平无显著性差异（F=4.083,P=0.443）,但其他临床参数（如:肿瘤位置、性别和年龄）与Caspase-8蛋白表达水平的关联无统计学意义。总体上看,Caspase-8 mRNA和蛋白表达水平与临床参数的相关性基本上一致。3.生存分析单变量生存分析结果显示,Caspase-8蛋白表达水平、肿瘤淋巴结转移、患者年龄和家族史与生存时间有统计学关联。食管癌患者中Caspase-8低表达的平均生存时间低于Caspase-8高表达的（P=0.045）,有淋巴结转移的患者的平均生存时间也显著低于无淋巴结转移的患者（P=0.000）,年龄较小的患者的平均生存时间比年龄较大的患者显著缩短（P=0.000）。此外,有家族史的患者的平均生存时间比无家族史的患者显著缩短（P=0.000）。多因素COX回归生存分析表明,Caspase-8蛋白表达水平、淋巴结转移和患者家族史与病人的生存时间相关,相对危险度分别是2.784（95%CI,0.888～5.727）,1.885（95%CI,1.545～2.517）和1.786（95%CI,1.217～2.389）。结论1.Caspase-8基因在食管癌组织中的mRNA和蛋白表达水平均显著低于其匹配正常食管组织,其低表达可能与食管癌的进展过程有着密切的关系。2.Caspase-8基因的表达水平影响着患者的预后:食管癌组织Caspase-8低表达患者的平均生存时间显著低于Caspase-8高表达的患者。因此Caspase-8可作为食管癌患者术后预后的一个评价指标,并可能成为基因治疗的一个作用靶点。