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第一部分Htr A2/Omi在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义目的检测Htr A2/Omi在上皮性卵巢癌组织及卵巢癌细胞株中的表达,探讨其与临床病理特征之间的关系。方法1.免疫组织化学法检测Htr A2/Omi在60例正常卵巢上皮组织及156例上皮性卵巢癌组织中的表达。2.Real-Time PCR法检测Htr A2/Omi m RNA在正常卵巢上皮组织及上皮性卵巢癌组织中的表达。3.分析Htr A2/Omi的表达与上皮性卵巢癌患者临床病理参数之间的关系。4.Real-Time PCR法和Western-blot法分别检测Htr A2/Omi m RNA及蛋白在正常卵巢上皮细胞株及卵巢癌细胞株中的表达。结果1.Htr A2/Omi在上皮性卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢上皮组织,两者之间比较差异具有统计学意义(P<0.001)。2.Htr A2/Omi m RNA在在上皮性卵巢癌组织中的表达明显高于正常卵巢上皮组织,两者之间比较差异具有统计学意义(P<0.001)。3.Htr A2/Omi的表达与上皮性卵巢癌患者的FIGO分期、淋巴结转移密切相关(P<0.001),而与患者年龄、肿瘤分化程度无明显相关性(P>0.05)。4.Htr A2/Omi m RNA及蛋白在卵巢癌细胞株OVCAR-3和A2780中的表达均明显高正常卵巢上皮组织,差异具有统计学意义(P<0.001)。结论1.Htr A2/Omi在上皮性卵巢癌组织中呈高表达,在正常卵巢上皮组织中呈低表达。2.Htr A2/Omi的表达与与上皮性卵巢癌患者的FIGO分期、淋巴结转移密切相关,与患者的年龄及肿瘤分化程度无关。3.Htr A2/Omi在卵巢癌细胞株OVCAR-3、A2780中均呈高表达。第二部分Htr A2/Omi基因沉默对卵巢癌细胞OVCAR-3凋亡、侵袭和转移影响的实验研究目的利用RNAi技术沉默Htr A2/Omi基因在卵巢癌细胞株OVCAR-3中的表达,观察干扰前后OVCAR-3细胞凋亡和侵袭能力的变化。方法1.脂质体法转染人卵巢癌OVCAR-3细胞,Real-Time PCR法及Western-blot法检测Htr A2/Omi基因沉默对OVCAR-3细胞中Htr A2/Omi表达的影响。2.MTT法观察Htr A2/Omi基因沉默对OVCAR-3细胞凋亡的影响。3.Transwell侵袭小室法观察Htr A2/Omi基因沉默对OVCAR-3细胞侵袭能力的影响。结果1.RT-PCR结果显示:与si RNA-CN组及对照组相比,OVCAR-3/si RNA-Htr A2/Omi组Htr A2/Omi的m RNA表达下降了91%,较si RNA-CN组及对照组均有统计学差异(P<0.01)。Western-blot结果显示:si RNA-Htr A2/Omi明显抑制了OVCAR-3细胞Htr A2/Omi蛋白的表达,与si RNA-CN组及对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。2.MTT结果显示:OVCAR-3/si RNA-Htr A2/Omi细胞凋亡率较si RNA-CN组、对照组降低,从第3天开始其差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Transwell侵袭实验结果显示:OVCAR-3/si RNA-Htr A2/Omi组细胞通过人工基底膜的数目与si RNA-CN组、对照组相比明显减少,差异具有统计学意义(P<0.01)。结论1.Htr A2/Omi基因沉默能降低卵巢癌细胞OVCAR-3的凋亡率。2.Htr A2/Omi基因沉默能增强卵巢癌细胞OVCAR-3的侵袭能力。第三部分Htr A2/Omi对OVCAR-3细胞裸鼠移植瘤生长的影响目的建立卵巢癌OVCAR-3细胞裸鼠移植瘤模型,将OVCAR-3/si RNA-Htr A2/Omi、OVCAR-3/si RNA-CN两种卵巢癌细胞分别接种于裸鼠皮下,观察两组裸鼠移植瘤生长情况、组织中细胞凋亡的检测及相关凋亡蛋白的表达情况。方法1.建立卵巢癌细胞裸鼠移植瘤模型:选用健康纯种的BALB/c-nude雌性裸鼠(18~20 g),鼠龄4-5周,在无菌SPF级的动物培养设备中饲养。60只裸鼠随机分为2组,实验组30只皮下注射OVCAR-3/si RNA-Htr A2/Omi细胞,对照组30只皮下注射OVCAR-3/CN细胞,建立裸鼠模型。2.观察裸鼠移植瘤成瘤情况:荷瘤裸鼠接种细胞后,每日观察裸鼠的一般状况,每周测量肿瘤结节的长径(a)和短径(b),并计算肿瘤的体积。连续饲养三周后脱臼处死裸鼠后剥除肿瘤称重。3.采用TUNEL法检测裸鼠移植瘤组织中细胞的凋亡情况。4.Real-Time PCR法和Western-blot法分别检测Htr A2/Omi及凋亡相关蛋白在裸鼠移植瘤中的表达。结果1.实验组裸鼠在接种后1周左右开始出现可触及的瘤体,之后瘤体生长迅速,接种3周以后,裸鼠体重增长缓慢,再之后裸鼠消瘦、体重下降、活动减少。对照组裸鼠于第三周开始出现可触及的瘤体,并且瘤体增长缓慢,裸鼠食欲好,体重增长较快,活动较多。3周以后所有被接种的裸鼠均有瘤体形成,并且全部存活。2.将裸鼠脱臼处死,剥除皮下移植瘤,测量肿瘤的长短径并称重,实验组肿瘤体积分别为1673±105.6mm3,对照组肿瘤体积分别为578±183.4mm3,实验组移植瘤体积均明显大于对照组,差异均具有统计学意义(P<0.001)。实验组瘤体重量分别为2.48±0.24克,对照组瘤体重量分别为0.91±0.25克,实验组瘤体重量明显大于对照组,差异有统计学意义(P<0.001)。3.TUNEL法检测结果表明,实验组移植瘤组织中棕色核细胞的数量相较于对照组而言较多,而且分布比较密集。实验组裸鼠移植瘤组织AI为6.04±0.19%,与对照组(AI=34.63±1.91%)相比,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.应用Westem-blot检测裸鼠移植瘤相关凋亡蛋白的表达,结果显示:实验组Htr A2/Omi蛋白表达较对照组降低,XIAP蛋白表达降低,caspase-3、caspase-9活性片段表达降低。结论1.下调Htr A2/Omi的表达对OVCAR-3细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有促进作用。2.下调Htr A2/Omi的表达可使裸鼠皮下移植瘤组织细胞的凋亡减少。3.在裸鼠体内下调Htr A2/Omi的表达通过下调XIAP的表达、抑制caspase-3、caspase-9的活性来抑制卵巢癌细胞的凋亡。