本课题基于肿瘤微环境特点,采用多种先进技术手段,结合多学科知识,构建了两种纳米递药系统,选择共递送Toll样4受体(Toll like receptor 4,TLR4)作为RNA干扰(RNA interference,RNAi)的治疗靶点,首次将TLR4 siRNA引入配合化疗药物用来联合治疗肿瘤,实现Dox诱导肿瘤细胞凋亡和下调TLR4蛋白的表达抑制肿瘤转移的双重作用。利用其特点制备了两种合成简便、肿瘤微环境响应型聚合物胶束,第一种聚合物胶束(Dimethylmaleic anhydride-Poly-L-lysine-Lipoic acid,DA-PLL-LA)能够响应肿瘤细胞间隙pHe(pH 6.6-6.8)和肿瘤细胞内氧化还原环境,包载化疗药物阿霉素(Doxorubicin,Dox),实现载体电荷反转来促进肿瘤细胞对载体的摄取,从而实现在肿瘤细胞内快速释药、增效减毒的作用。第二种聚合物胶束以核酸适体AS1411为靶向分子连接阳离子聚合物载体构成具有主动靶向作用的肿瘤细胞内pH/还原双重敏感型聚合物载体(AS1411-Chitosan-ss-Polyethyleneimine-Urocanic acid,ACPU),共递送TLR4-siRNA和化疗药物Dox,以期实现基因和药物联合治疗来降低肿瘤细胞的恶性增殖同时抑制其转移和侵袭,探讨该系统在抑制原位肺癌的增殖和转移中的作用和效果,为实现肿瘤精准高效治疗提供新的指导策略。第一部分:前言众所周知,癌症仍然是一大世界难题,近年来,恶性肿瘤发病率多年以来持续上升,已然成为一个亟待解决的社会问题。在肿瘤的临床治疗中,目前仍然以手术、化疗和放疗为主,单一化疗药物的使用对人体会产生较大的毒副作用,而新型纳米载体递药系统的出现则可以很大程度上改善这一问题,本章着重综述纳米载体、肿瘤微环境响应型纳米递送系统、纳米递送系统在肿瘤治疗中的应用,以及结合治疗策略等的相关研究文献,对其研究进展及相关应用做了探讨和分析,并且就本论文的两种聚合物胶束的选题指导思想作了阐述。第二部分:可电荷反转的肿瘤微环境响应型聚合物递药系统的研究本章成功制备了一种肿瘤细胞微环境响应型聚合物DA-PLL-LA,通过核磁氢谱进行表征,LA(Lipoic acid)的接枝率是42.17%,DA(Dimethylmaleic anhydride)的取代度是14.52%。该载体在肿瘤细胞外偏低pH下可实现电荷反转,pH 6.8条件下DA在2小时内的降解率约80%,有利于胶束在病灶部位的摄取;测得pH 7.4条件下,载体的平均粒径为(117±2.86)nm,电位为(-16.5±1.28)mV,TEM显示胶束的形态圆整,分布较为均匀。在pH 6.8+10 mMGSH条件下,DA-PLL-LA胶束电位为(7.9±3.02)mV,实现电荷反转,胶束结构不稳定,粒径显著增大,有利于胶束内核中药物的释放。测得临界胶束浓度为3.98×10-3 mg/mL,具有良好的稳定性,可作为药物载体。在pH 7.4生理条件下,DA-PLL-LA胶束的血清稳定性较好,毒性小,蛋白吸附率低,生物相容性良好。该载体能够成功包载化疗药物Dox制得载药胶束Dox/DA-PLL-LA,包封率和载药量分别为(93.6±2.26)%和(22.4±2.52)%,可通过EPR效应有效的蓄积于肿瘤部位;Dox/DA-PLL-LA胶束在pH 6.8+10 mM GSH条件下释药量最大,释放行为符合骨架型释药模型特点,该载体在血液循环中保持稳定,有效抑制药物的早释,能够在肿瘤细胞内实现定点释放药物。以A549细胞作为细胞模型,在pH 6.8条件下,Dox/DA-PLL-LA细胞摄取和细胞毒性比生理条件下效果更加显著。在体外3D肿瘤球以及实体瘤切片中可以看出DA-PLL-LA具有很好的肿瘤穿透性。荷皮下瘤裸鼠内药效试验表明,所制得的聚合物胶束DA-PLL-LA具有良好的靶向性,可有效的蓄积到病灶部位,肝脏毒性较小,可以通过EPR效应将药物靶向递送至肿瘤部位,对药物进行有效控释,从而增强Dox对肿瘤细胞的治疗效果,是具有开发潜力的抗肿瘤的优良载体。第三部分:核酸适体介导的pH-还原双敏感聚合物胶束共递送药物与基因靶向治疗肿瘤的增殖与转移本章成功合成了一种具有靶向功能的pH/氧化还原双重敏感型聚合物胶束ACPU,通过核磁氢谱、碳谱和圆二色谱对ACPU的结构进行表征,测得CSO(Chitosan)和UA(Urocanic acid)的接枝率分别为3.33%和44.4%,并且ACPU在制备过程中并没有影响AS1411的二级结构。测得ACPU的粒径约为(124.6±1.068)nm,电位为(24.2±0.529)mV,TEM观察得出胶束形态较为圆整,分布较为均匀。载体在pH 5.3+GSH条件下粒径变化显著,胶束结构不稳定,体现了载体的pH/还原双重敏感性。测得临界胶束浓度为7.94×10-3 mg/mL,具有良好的稳定性,可作为药物载体;测得ACPU胶束的包封率和载药量分别为(85.81±1.22)%和(14.26±1.09)%。凝胶电泳色谱结果表明载体与siRNA最佳N/P为6,通过酶保护试验和血清稳定性试验考察该载体能够减缓核酸酶和血清对siRNA的降解,有效保护siRNA的活性。共载基因和药物以后,载体的粒径和电位较空白载体而言没有明显变化。体外释放结果证明了该纳米递药系统在生理条件下可有效避免基因和药物提前释放,在pH 5.3+GSH条件下能够实现基因和药物的快速释放以A549细胞为细胞模型,ACPU载药胶束表现出对A549细胞较好的细胞毒性。通过共聚焦显微镜和活细胞工作站观察载体的亚细胞定位和细胞摄取情况,发现载体能够成功递送基因和药物进入肿瘤细胞,并且通过摄取动力学计算得出ACPU胶束显示出最高的摄取速率和最低的消除速度。该胶束在3D肿瘤球模型中体现出良好的肿瘤穿透性。此外,该载体能够成功转染TLR4-siRNA进入肿瘤细胞,成功下调TLR4表达,有效抑制A549细胞的侵袭和转移。在裸鼠中建立A549原位癌模型,体内试验表明ACPU胶束在荷原位瘤裸鼠中具有良好的肿瘤靶向能力,并且表现出明显的抗肿瘤效果,降低Dox系统毒性。综合而言,这种核酸适配体介导的聚合物胶束能够快速响应肿瘤微环境,实现基因和药物的高效递送,为靶向治疗肿瘤提供了一种策略。