研究背景及目的非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)是一个临床病理学的概念,是指肝组织病理学上表现为肝细胞脂肪变性、肝小叶内炎症细胞浸润、糖原核和Mallory小体,可伴不同程度纤维化,但无明确饮酒史的一种慢性肝病,是隐源性肝硬化的重要原因,也是代谢综合征的表现之一。关于NASH的发病机制,目前公认的“二次打击”学说认为:初次打击主要为胰岛素抵抗,胰岛素抵抗通过促进外周脂肪分解和高胰岛素血症引起肝细胞脂肪变性,并启动细胞适应程序,而脂肪变性的肝细胞活力相对不足并为氧应激提供了足够的反应基质,结果脂肪变性的肝细胞对内外源性损害因子的敏感性增强;二次打击主要为反应性氧化代谢产物增多,导致脂质过氧化伴细胞因子、线粒体解偶联蛋白-2和Fas配体被诱导活化,进而引起肝组织发生炎症、坏死甚至纤维化。NASH的发生是脂肪变性本身、氧化应激及内毒素的相互作用的结果。NASH的治疗目前尚缺乏有效药物,由于NASH的病因以肥胖、2型糖尿病、高脂血症最为常见,故针对这些疾病的治疗无疑是NASH治疗的基础。另外根据“二次打击”学说,氧应激和脂质过氧化损伤在NASH的发病中起着重要作用,提示抗氧化治疗是NASH治疗的重要对策,可望阻止NASH进展,目前已有文献报道用维生素E、甜菜碱、苦参碱、牛磺酸等具有抗氧化作用的药物治疗NASH患者可显著降低血清转氨酶水平,明显减轻肝脏脂肪变性、炎症和纤维化程度。槐果碱是从中药苦豆子中提取的一种苦参型生物碱,结构与苦参碱类似。文献报道,槐果碱在安全剂量下毒副作用小,其体内分布组织内浓度较血液高,且价廉,具有较好的临床应用前景。目前研究证明槐果碱在体外可以灭活内毒素,控制内毒素通过单核一巨噬细胞系统在体内激活引起的炎症反应,减轻内毒素对机体造成严重损害,如全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等。另有报道槐果碱在体外具有显著的抑制肝细胞分泌HBsAg、HBeAg的作用,是一个高效低毒的抗乙肝病毒的有效药物。我们以前的研究表明槐果碱可显著减轻实验性肝纤维化程度,改善肝功能。关于其是否具有抗NASH作用尚未见报道。本研究主要探讨槐果碱对NASH的防治作用及其作用的可能机理。研究方法(一)大鼠实验性NASH模型的制备8只160g左右SD雄性大鼠,随机分为2组,每组4只。Ⅰ组为正常组,喂饲普通饲料12周;Ⅱ组为模型组,喂饲高脂饲料(基础饲料+100g/kg猪油+20g/kg胆固醇)12周。12周末给大鼠禁食12小时,称量体重后予20%乌拉坦腹腔注射麻醉,剖开腹腔,切取全部肝脏,观察肝脏大体外观。从肝右叶切取组织用生理盐水冲洗后浸泡在10%中性缓冲福尔马林溶液中。将福尔马林浸泡的组织,用石蜡包埋,连续切片,行HE染色观察肝细胞脂肪变性程度和肝组织炎症反应程度。对比两组大鼠大体标本和病理结果,评估NASH模型制备情况。(二)槐果碱对大鼠NASH的防治作用32只180g左右SD雄性大鼠,随机分为4组,每组8只。Ⅰ组为正常组,喂饲普通饲料12周;Ⅱ组为模型组,喂饲高脂饲料(基础饲料+100g/kg猪油+20g/kg胆固醇)12周;Ⅲ组为槐果碱预防组,喂饲高脂饲料同时予槐果碱背部皮下注射(20mg/kg体重/d)12周;Ⅳ组为槐果碱治疗组,喂饲高脂饲料12周,第5周开始予槐果碱背部皮下注射。实验第12周末给大鼠禁食12小时,称量体重后予20%乌拉坦腹腔注射麻醉,剖开腹腔,经下腔静脉抽血,化验血清血脂(Tch、TG、HDL、LDL)和肝功(ALT、AST)。切取全部肝脏,称肝重,计算肝指数。从肝右叶切取部分组织用生理盐水冲洗后浸泡在10%中性缓冲福尔马林溶液中,再取部分组织-70℃液氮冻存。将福尔马林浸泡的组织,用石蜡包埋,连续切片,行HE染色、V-G染色观察肝组织炎症反应程度和纤维沉积情况,并进行炎症活动度(G)的分级和纤维化程度(S)的分期。部分肝组织冰冻切片行苏丹Ⅲ染色,观察肝细胞脂肪变性程度。用免疫组织化学方法检测肝组织白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和转化生长因子-β1(TGF-β1)蛋白表达情况。将部分冻存组织匀浆,用RT-PCR技术检测肝组织脂联素(adiponectin)、瘦素(leptin)、IL-6、TNF-α、TGF-β1、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和I型前胶原(Procollagen-I)的mRNA的表达。(三)统计学处理所有数据以均数±标准差( x±s)表示,组间比较用方差分析;病理和免疫组化分级采用秩和检验。统计结果用SPSS11.0软件包处理,P<0.05为差异有显著性。研究结果(一)大鼠实验性NASH模型的制备大鼠喂饲高脂饲料12周后可见其肝脏体积较正常鼠明显增大,包膜紧张,边缘圆钝,表面呈奶黄色;肝脏HE染色显示肝细胞重度脂肪变性,并可见Mallory小体,肝小叶内炎症细胞浸润及肝细胞点状或融合性坏死灶。正常组大鼠肝脏未见上述改变。表明用高脂饲料能成功复制出NASH模型。(二)槐果碱对大鼠NASH的防治作用1.槐果碱对肝重、肝指数的影响:正常组肝重为14.885±1.591g,肝指数为0.0319±0.0019;模型组肝重为18.905±2.110g,肝指数为0.0381±0.0038;槐果碱预防组肝重为14.440±1.997g,肝指数为0.0312±0.0020;槐果碱治疗组肝重为15.766±1.777g,肝指数为0.0328±0.0026。模型组肝重、肝指数较正常组明显升高(P<0.05),槐果碱干预组肝重、肝指数较模型组明显下降(P<0.05),但预防组与治疗组间无显著性差异(P>0.05)。2.槐果碱对肝功能的影响:正常组血清ALT为35.38±5.19 U/L ;模型组为73.00±19.54U/L;槐果碱预防组为52.13±10.53U/L;槐果碱治疗组为54.86±8.42 U/L。模型组血清ALT较正常组明显升高(P<0.05),槐果碱干预组血清ALT较模型组明显下降(P<0.05),但预防组与治疗组间无显著性差异(P>0.05)。血清AST在槐果碱干预组与模型组间无显著性差异(P>0.05)。3.槐果碱对血脂的影响:正常组血清Tch、TG、HDL、LDL分别为0.56±0.239 mmol/L,0.26±0.071 mmol/L,1.10±0.150 mmol/L,0.25±0.063 mmol/L;模型组分别为4.28±0.572mmol/L,0.40±0.149mmol/L,2.04±0.193mmol/L,2.85±0.512 mmol/L;槐果碱预防组分别为3.07±0.846mmol/L,0.27±0.082 mmol/L,1.55±0.254mmol/L,2.31±0.669 mmol/L;槐果碱治疗组分别为3.95±0.906 mmol/L,0.33±0.067 mmol/L,1.78±0.266 mmol/L,2.81±0.832 mmol/L。模型组血清Tch、TG、HDL、LDL较正常组明显升高(P<0.05);槐果碱预防组血清Tch、TG、HDL较模型组明显下降(P<0.05),LDL较模型组无明显下降(P>0.05);槐果碱治疗组血清HDL较模型组明显下降(P<0.05),Tch、TG、LDL较模型组无明显下降(P>0.05)。4.槐果碱对组织病理的影响:HE染色显示槐果碱干预组肝组织炎症反应程度较模型组明显减轻(P<0. 05);苏丹Ⅲ染色显示槐果碱干预组肝细胞脂肪变性程度较模型组明显减轻(P<0. 05);V-G染色显示槐果碱干预组肝组织纤维化程度较模型组明显减轻(P<0. 05)。预防组较治疗组脂肪变性、炎症反应、纤维化程度轻,但两组间差异无显著性(P>0.05)。5.槐果碱对肝组织中细胞因子表达的影响:免疫组化显示槐果碱干预组肝组织中IL-6、TNF-α、TGF-β1蛋白表达较模型组明显降低(P<0. 05)。RT-PCR检测显示槐果碱干预组肝组织中IL-6、TNF-α、TGF-β1 mRNA表达较模型组明显降低(P< 0. 05),Leptin、α-SMA、Procollagen-I mRNA表达也较模型组明显降低(P<0. 05),而Adiponectin mRNA表达较模型组明显升高(P<0. 05)。上述指标在槐果碱预防组与治疗组间差异无显著性(P>0.05)。研究结论:(一)喂饲高脂饲料12周后能成功制备大鼠NASH模型。(二)槐果碱对大鼠NASH进程有显著防治作用,可降低血清转氨酶水平,减轻肝脏脂肪变性、炎症和纤维化程度。(三)减少炎症细胞因子的产生,增加保护性细胞因子的合成,可能是槐果碱抗NASH作用的重要机理。