背景与目的肺癌是世界上发病率、死亡率最高的恶性肿瘤之一，严重危害人类生命和健康。近年来尽管肺癌的临床诊断技术与治疗技术不断改进与提高，但依然因缺乏有效的肺癌早期诊断方法，临床上仅有20-25%的非小细胞肺癌可获得早期诊断，导致肺癌死亡率一直持续稳定在85%的高水平。众多流行病学研究资料表明吸烟是诱发肺癌的首要危险因素，香烟烟雾中含有多种与肺癌关系密切的化学致癌物质或诱变剂。这些物质可通过氧化应激、DNA损伤等不同机制，引起支气管上皮细胞损害、癌基因激活、抑癌基因突变和失活等导致细胞遗传信息转化而发生癌变。近年来随着miRNA的不断深入研究，人们发现miRNA不仅广泛参与细胞增殖、分化、凋亡、上皮细胞间质转型、组织器官形成和生长发育等正常生理过程，也广泛参与各种疾病的发生、发展过程，特别与恶性肿瘤的发生、发展、转移等病理过程关系密切。众多有关肺癌的miRNA研究结果提示，miRNA不仅可做为肺癌早期诊断的分子生物标记物，同时也可做为肺癌治疗的分子靶标而用于肺癌的治疗，以及肺癌治疗效果的预后评估。近五年来有关香烟暴露与miRNA的研究表明，香烟烟雾可诱发人和鼠肺、肝等组织的miRNA表达变化。因此通过香烟暴露诱发miRNA表达变化与肺癌之间关系的研究，将有助于深入了解香烟暴露致肺癌发生的分子作用机制。但限于健康吸烟人肺组织标本的获取困难，临床上难以通过获取正常吸烟人肺组织进行连续的观察。而近年来随着循环miRNA的研究发现，循环miRNA具有良好的微侵袭性、高度组织特异性、稳定性等特点，可能是肿瘤早期诊断的理想分子生物标记物和肿瘤治疗的靶标。鉴于循环miRNA的这些优点，我们将通过研究血清miRNA在正常人群、吸烟人群和肺癌人群间的表达变化，阐明香烟暴露条件下血清miRNA表达水平变化与肺癌血清miRNA之间关系；其次分析比较血清特异性的miRNA表达变化与肺癌病理类型、吸烟指数之间的剂量效应关系；最后通过吸烟诱导特异性改变的miRNA作用的靶基因和信号通路预测，了解吸烟诱导肺癌变过程中血清miRNA可能参与的作用机制。研究内容与方法第一部分：吸烟与肺癌患者血清microRNA差异性表达研究胸部CT等影像学检查初步诊断为肺癌，未经过手术治疗、放射治疗或化学治疗的男性患者，经术后病理诊断为非小细胞肺癌者入选为肺癌组（84例）。健康体检的男性人群进行吸烟问卷调查，入选健康吸烟组100例，入选健康不吸烟组49例。采集、分离获得各组入选对象的空腹血清。选取肺癌组中肺腺癌和肺鳞癌血清样品各5例、健康吸烟组和健康不吸烟组血清样品各10例。将三组中的10例血清样品等体积混合后，分别抽提三组混合样品的RNA。采用Exiqon的miRCURYTM LNAArray (v.16.0)进行基因表达谱检测，获取各组miRNA表达谱，分别比较各组间miRNA表达谱的差异性。第二部分：吸烟者血清let-7i-3p、miR-154-5p差异性表达及与肺癌变的关系我们分别选取健康不吸烟组、健康吸烟组和肺癌组各30例样品，对芯片结果显示呈三倍及以上差异表达的miR-7-5p，miR-502-3p，miR-200c-5p，miR-1301，miR-129-2-3p、let-7i-3p、miR-196a-3p和miR-154-5p等8个miRNA进行实时定量PCR验证。验证后选取显著下调表达的let-7i-3p和miR-154-5p两个miRNA，分别增加健康不吸烟组、吸烟组、肺癌组标本例数进行实时定量PCR检测，并结合肺癌的病理类型、吸烟指数变化，分析比较三组间let-7i-3p和miR-154-5p表达水平与肺癌病理类型、吸烟指数变化的关系。通过mirbas、miranda和targetscan三个数据库对let-7i-3p和miR-154-5p进行靶基因预测，通过KEGG pathways对预测的靶基因进行信号通路的预测分析，通过靶基因和信号通路的预测了解let-7i-3p和miR-154-5p在吸烟在肺癌变过程中的意义。结果第一部分：吸烟与肺癌患者血清microRNA差异性表达研究1. miRNA芯片表达谱结果显示，健康不吸烟组、健康吸烟组和肺癌三组血清样品中448个miRNA显示有阳性信号，用于进一步的数据分析表达。其中健康吸烟组与健康不吸烟组比较有105个miRNA呈三倍及以上差异性表达，其中上调和下调表达的miRNA分别为32个、75个。肺癌组与健康不吸烟组比较有163个miRNA呈三倍及以上差异性表达，其中上调和下调表达的miRNA分别为74个、89个。两组血清miRNA表达与相关文献报道的肺癌组织中miRNA表达谱变化相似，均以miRNA下调表达为主。2.在健康吸烟组与健康不吸烟组、肺癌组与健康不吸烟组比较中，两者之间呈相同表达变化的miRNA有85个，分别占健康吸烟组与健康不吸烟组差异表达miRNA的80.95%（85/105）和肺癌组与健康不吸烟组的52.15%（85/163）。而肺癌组与健康不吸烟组、肺癌与吸烟组比较中，两者间呈相同差异性表达的比率分别为16.56%（27/163）、36.98%（27/73）。三组间相互比较的结果表明健康吸烟与肺癌患者血清miRNA表达谱改变高度类似。观察健康吸烟组与健康不吸烟组、肺癌组与健康不吸烟组中呈相同三倍及以上差异性表达的miRNA，均未发现在健康吸烟组与健康不吸烟组、肺癌组与健康不吸烟组中存在相反表达的miRNA。提示肺癌血清的miRNA表达改变可能是吸烟诱导血清持续改表的结果。第二部分：吸烟者血清let-7i-3p、miR-154-5p差异性表达及与肺癌变的关系1.根据miRNA芯片结果选取miR-7-5p，miR-502-3p，miR-200c-5p，miR-1301，miR-129-2-3p、let-7i-3p、miR-196a-3p和miR-154-5p等miRNA进行初步验证，结果发现，let-7i-3p和miR-154-5p在健康吸烟组与健康不吸烟组、肺癌组与健康不吸烟组比较中，呈显著下调表达。增加三组的样品量进一步证实，与健康不吸烟组相比，let-7i-3p、miR-154-5p在健康吸烟组和肺癌组中均呈下调表达，差异均有统计学意义。2. let-7i-3p相对表达水平与肺癌的病理类相关。与健康不吸烟组和健康吸烟组比较，let-7i-3p在肺鳞癌组中表达下调，有统计学意义； let-7i-3p在肺腺癌组中表达无统计学差异。3. miR-154-5p相对表达水平在不同肺癌的病理类型中出现相同的变化。与健康不吸烟组比较，miR-154-5p在鳞癌组和腺癌组中均呈表达下调，有统计学意义。与健康吸烟组比较，miR-154-5p在鳞癌组和腺癌组中表达差异无统计学意义。与腺癌组相比，miR-154-5p在鳞癌组中表达差异无统计学意义。4. let-7i-3p和miR-154-5p的相对表达水平与吸烟指数的相关分析发现，随着吸烟指数增加，let-7i-3p和miR-154-5p的相对表达水平水平逐渐降低。吸烟指数与let-7i-3p和miR-154-5p的表达水平均呈负相关。5.与健康不吸烟组相比，肺癌吸烟组和肺癌不吸烟组中的let-7i-3p均呈下调表达，差异有统计学意义；与健康吸烟组相比，肺癌不吸烟组中的let-7i-3p呈上调表达，差异有统计学意义，而肺癌吸烟组中的let-7i-3p的表达差异无统计学意义；与肺癌不吸烟组相比，肺癌吸烟组中的let-7i-3p的呈下调表达，差异有统计学意义。6.与健康不吸烟组比较，肺癌吸烟组及肺癌不吸烟组中的miR-154-5p的表达均呈下调，差异有统计学意义；与健康吸烟组相比，肺癌吸烟组和肺癌不吸烟组中的miR-154-5p的表达均无统计学差异；与肺癌不吸烟组相比，肺癌吸烟组中的miR-154-5p的表达差异无统计学意义。7.通过靶基因预测发现，let-7i-3p作用的主要靶基因有Adhfe1、ACTB、ATP2A2、BDNF、BTG3、EMP2、DLX5、CXCR6、CXCL12、HES1、RASSF3、Six1等，这些靶基因的信号通路预测结果显示，其主要参与与肺癌发生、发展、侵袭关系密切的NF-kappaB、MAPK、Notch等信号通路。8.通过靶基因预测发现，miR-154-5p作用的主要靶基因有Abcc9、ROS、ATG7、TNFAIP3、CUL2等。这些靶基因的信号通路预测结果显示，其主要参与与肺癌发生、发展、侵袭关系密切的NF-kappa B、HIF-1、MAPK、自噬分子调控等信号通路。结论1.吸烟可诱导人血清miRNA的差异表性表达，表达谱以差异性下调表达为主，其血清miRNA的表达谱变化与肺癌血清表达谱变化趋向一致，提示吸烟诱发的血清miRNA表达变化可能与肺癌的形成、发生、发展有关。2.吸烟可诱导血清let-7i-3p和miR-154-5p持续性下调表达，与吸烟指数呈负相关。血清let-7i-3p和miR-154-5p在肺癌血清中呈下调表达，let-7i-3p下调表达水平与非小细胞肺癌病理类型有关，miR-154-5p下调表达水平与吸烟史相关，结果提示let-7i-3p和miR-154-5p可能均参与了吸烟诱发肺癌的的分子调节机制，但两种miRNA参与的调节机制并不完全相同。3. let-7i-3p和miR-154-5p的靶基因和信号通路预测分析，结果提示let-7i-3p和miR-154-5p可能通过作用多个靶基因和信号通路参与、调控非小细胞肺癌的发生、发展、侵袭、转移等病理过程。