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脂肪与肥胖相关基因(Fat and obesity associated gene,FTO)属于非血红素双加氧酶超家族的一员,该基因转录翻译的蛋白质参与细胞内多个生理学进程,如细胞的增殖、凋亡、分化和细胞周期等。肥胖是Ⅱ型糖尿病最主要的风险因子,而FTO突变体会影响肥胖发生与Ⅱ型糖尿病的易患性。通过研究欧洲大量不同年龄及BMI指数的人的FTO基因与BMI、预测体重过重及肥胖的相关性得知从出生到老去整个过程中FTO与BMI和衰老密切相关(Frayling et al.,2007)。此外,FTO序列中包含着的多个有潜在功能的SNP位点与欧洲人口中的早发性及严重肥胖特征高度相关。因此,FTO基因对能量平衡的影响仍需要深入研究(Dina et al.,2007)。有研究表明超表达FTO后猪肌内脂肪前体细胞的增殖与分化增强(Zhang et al.,2015)。细胞凋亡作为细胞重要的生理活动是否受FTO调控还不清楚。本研究利用qPCR、Western blotting、免疫荧光、转录组测序、免疫组化等方法,探究FTO通过缓解线粒体未折叠蛋白反应(线粒体UPR,UPRmt)抑制小鼠脂肪细胞凋亡的作用及其机制,这些结果将为深入揭示UPRmt与脂肪细胞凋亡的互作关系以及预防脂肪代谢紊乱征提供一定试验证据。本研究获得以下研究结果:1.FTO通过激活JAK2/STAT3信号通路抑制脂肪细胞凋亡。环亮氨酸(CL)处理3T3-L1细胞极显著上调FTO mRNA水平(P<0.01),但凋亡标志基因Caspase-3、Bax的mRNA水平显著下降,Bcl-2的mRNA水平显著提升(P<0.05);甜菜碱(Bet)处理作用相反。通过转录组测序发现超表达FTO上调Bax与XAF1的转录水平,qPCR验证结果一致。超表达FTO后细胞增殖标志基因p27、p53与凋亡标志基因Caspase-3、Caspase-9与Bax mRNA水平显著下调(P<0.05),PCNA、CyclinE与Bcl-2 mRNA水平显著上调(P<0.05)。棕榈酸(PA)诱导凋亡模型下FTO进一步下调促凋亡基因的mRNA和蛋白水平(P<0.05),上调抑凋亡基因的mRNA和蛋白表达水平(P<0.01);TUNEL等染色及免疫荧光的结果显示超表达FTO抑制脂肪细胞凋亡(P<0.05)。从测序结果中筛选出JAK2/STAT3信号通路并用抑制剂SD1008处理发现超表达FTO激活该信号通路蛋白磷酸化并抑制下游Caspase-3切割(P<0.05)。2.FTO通过降低HSP60 mRNA m6A甲基化水平抑制UPRmt。烟酰胺核糖(NR)处理脂肪细胞构建UPRmt模型后用FTO处理脂肪细胞检测发现线粒体呼吸链标志基因的mRNA水平显著下调(P<0.05),线粒体生物合成相关基因的mRNA水平显著下调(P<0.05);超表达FTO对HSP60 mRNA水平无显著影响,但ClpP mRNA水平被显著抑制(P<0.05),模型下HSP60和ClpP的mRNA水平显著上升(P<0.05);与对照组相比,超表达FTO显著抑制HSP60和ClpP蛋白水平表达。为了进一步研究FTO调控脂肪细胞UPRmt的分子机制,用CL及Bet处理脂肪细胞检测发现这两种药物对HSP60及ClpP的mRNA水平无显著影响,但CL处理抑制HSP60的蛋白水平(P<0.05),而Bet处理作用相反(P<0.05),预测HSP60 mRNA的m6A修饰位点并突变,突变后的载体处理脂肪细胞发现HSP60的mRNA水平无显著变化,突变组的HSP60蛋白水平显著下调(P<0.05);突变后超表达FTO处理脂肪细胞发现HSP60的mRNA及蛋白水平都无显著变化。以上结果表明FTO通过降低HSP60mRNA的m6A水平抑制脂肪细胞UPRmt。3.FTO通过抑制线粒体UPR缓解脂肪细胞凋亡。PKR抑制剂2-AP及FTO处理脂肪细胞检测发现2-AP显著抑制PKR/eIF-2α信号通路的激活(P<0.05),而超表达FTO进一步下调PKR/eIF-2α信号通路的蛋白磷酸化水平(P<0.05),UPRmt模型下线粒体中的ATF5蛋白水平显著下降(P<0.05),而核中的ATF5蛋白水平显著上升(P<0.05),超表达FTO处理脂肪细胞检测发现ATF5的转移被显著抑制(P<0.05);干扰ATF5处理脂肪细胞检测发现ATF5及Bax mRNA水平显著下降(P<0.05),超表达FTO后ATF5及Bax mRNA水平被进一步下调(P<0.05);在脂肪细胞及组织上处理FTO及NR检测发现超表达FTO显著抑制UPRmt模型下促凋亡基因的mRNA水平(P<0.05)及蛋白水平(P<0.05),显著上调抑凋亡基因Bcl-2的mRNA及蛋白水平(P<0.05);HE染色发现超表达FTO处理后脂肪组织中脂滴数量增多(P<0.05),NR处理后减少脂滴数量(P<0.05)。免疫组化显示超表达FTO后脂肪组织中Bcl-2蛋白表达水平显著上升(P<0.05),NR处理后缓解超表达FTO对Bcl-2的上调(P<0.05),Bax蛋白表达与Bcl-2相反。本试验结果显示FTO抑制脂肪组织中UPRmt介导的促凋亡基因的表达。本试验证明了FTO促进JAK2/STAT3信号通路激活抑制脂肪细胞凋亡并通过降低HSP60 mRNA的m6A水平抑制UPRmt。本研究结果揭示了线粒体UPR在脂肪细胞凋亡调控中的作用,为深入研究脂肪代谢及功能提供理论基础,进一步为肥胖等代谢综合征的治疗提供研究思路。