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研究目的:评价不同栽培品种与不同加工方式对凉粉草质量的影响,采用体外降脂活性实验、人肝癌HepG2细胞脂肪积聚模型评价凉粉草提取物的体外抗氧化活性以及对体外脂肪积聚细胞模型的干预作用,为凉粉草资源开发提供参考。方法:1.不同加工方式对凉粉草质量的影响将从不同产地采集的两种凉粉草药材按照微发酵、阴干、烘干三种方式加工,采用紫外分光光度法分别对凉粉草茎、叶中总黄酮、总糖含量进行测定;采用高效液相色谱法(HPLC)测定凉粉草HPLC特征图谱,通过中药色谱指纹图谱相似度评价软件进行相似度分析,并进行聚类分析;建立顶空-气质联用(Headspace-gas chromatography-mass spectrometry,HS-GC-MS)测定凉粉草药材挥发性成分的方法,比较其挥发性成分差异。初步评价不同加工方式对凉粉草药材质量的影响。2.凉粉草提取物体外活性研究2.1凉粉草提取物抗氧化活性分析以水为溶剂通过超声提取法制备得到凉粉草水提物(Aqueous extract,AE),以50%乙醇为溶剂通过回流提取发制备凉粉草醇提物(Ethanol extract,EE),AE经醇沉、脱蛋白处理纯化得到粗多糖(Mesona chinensis Benth crude polysaccharide,MCP),EE经大孔树脂纯化富集得到总黄酮纯化物(Mesona chinensis Benth total flavonoid purify,MTF),并采用不同浓度的乙醇溶液分级洗脱制备醇提物的大孔树脂分级洗脱物(F0、F10、F20、F30、F40、F50),通过1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除试验、铁离子还原法(Ferric ion reducing antioxidant power,FRAP)测定上述提取物的体外抗氧化能力。2.2细胞模型评价凉粉草提取物降脂和胰岛素抵抗活性研究采用0.2mmol/L油酸(Oleic acid,OA)诱导建立人肝癌HepG2细胞脂肪积聚模型,以辛伐他汀为阳性对照,不同提取物均设置高、中、低剂量干预组(高、中、低剂量分别为200、100、50μg/mL),通过油红O染色试验测定总脂质,并检测细胞内甘油三脂(Triglyceride,TG)水平,比较凉粉草提取物的体外降脂活性;通过腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)抑制剂Compound C干预考察凉粉草提取物对AMPK的调控作用;采用高浓度胰岛素诱导人肝癌 HepG2 细胞胰岛素抵抗模型(Insulin resistance-HepG2,IR-HepG2),以二甲双胍为阳性对照,通过测定细胞葡萄糖消耗量评价凉粉草提取物体外胰岛素抵抗活性。结果:1.不同加工方式对凉粉草质量的影响两种凉粉草栽培品种总黄酮、总糖含量差异较小,台湾草与本地草HPLC图谱色谱峰组成区别较大,但均含有咖啡酸、异槲皮素、迷迭香酸、紫云英苷、紫草酸、丹酚酸B六种已知共有成分,其中异槲皮素主要存在于叶中,而紫草酸主要存在于茎中;HS-GC-MS检测发现,两种栽培品种凉粉草药材香气成分组成差异较大,其中本地草(叶)相对百分含量较高的成分包括β-石竹烯(26.31%)、α-石竹烯(7.87%)、正已醛(5.45%),台湾草(叶)相对百分含量较高的为β-芹子烯(11.72%)、β-石竹烯(10.47%)、α-红没药醇(6.18%)、α-芹子烯(5.28%),台湾草中α-红没药醇含量高于本地草。不同加工方式的凉粉草药材中总黄酮、总糖含量存在一定差异,发汗处理的凉粉草中总黄酮含量低于阴干样品;发汗处理后的样品中紫云英苷的含量明显降低,但对咖啡酸和迷迭香酸含量影响较小;发汗捂闷一次处理的样品挥发性成分与阴干样品的差异较小,但捂闷2次后,样品中石竹烯的相对含量显著下降(β-石竹烯0.85%、α-石竹烯0.37%),而对α-芹子烯和β-芹子烯影响较小。2.凉粉草提取物体外活性研究凉粉草提取物具有良好的体外抗氧化活性,其中活性较好的部位为:MTF>F30>F10>F40,其中 MTF(IC50=5.323μg/mL)与 30%乙醇洗脱物(IC50=5.278μg/mL)对 DPPH 自由基清除能力与阳性对照 VC(IC50=5.565μg/mL)相近,MTF的FRAP值显著高于其他提取物(P<0.01),F30的FRAP值显著高于F10和F40(P<0.01);凉粉草提取物对油酸诱导的人肝癌HepG2细胞脂肪积聚具有缓解作用,凉粉草醇提物经过富集纯化后,其体外降脂活性有一定提升,通过Compound C干预实验发现,凉粉草提取物在一定程度上能够缓解Compound C对AMPK的抑制作用(P<0.01);与凉粉草水提物相比,凉粉草醇提物以及经过大孔树脂纯化处理后的产物具有较好的体外胰岛素抵抗活性。结论:本研究通过对不同栽培品种、不同加工方式的凉粉草药材样品进行质量检测分析,发现不同栽培品种凉粉草药材HPLC特征图谱及其挥发性成分主体组成相似,但二者特征成分差异明显,或可作为凉粉草药材栽培品种鉴别的依据,并为进一步完善凉粉草药材质量控制标准提供参考,不同加工方式对凉粉草总糖影响较小,但发汗处理后黄酮类成分含量降低,此外,不同加工方式的凉粉草HPLC特征图谱以及挥发性成分组成存在差异;凉粉草提取物体外抗氧化、体外降脂活性试验及体外胰岛素抵抗活性试验结果显示其具有良好活性,可为进一步体内活性实验验证和活性成分筛选提供参考。