论文部分内容阅读
目的观察全骨髓贴壁法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的传代、鉴定及成骨分化、成脂分化的情况,为进一步研究BMSCs提供功能稳定的种子细胞。方法采用全骨髓贴壁培养法对SD大鼠BMSCs进行分离、培养、纯化。在倒置相差显微镜下动态观察活体细胞形态学改变；MTT比色法测定OD值绘制生长曲线；用流式细胞仪鉴定BMSCs表面抗原；使用成骨诱导液及成脂诱导液分别诱导其向成骨细胞、成脂肪细胞分化。结果(1)全骨髓贴壁法分离培养的BMSCs为贴壁生长的成纤维样细胞,传代后的细胞形态均一,呈漩涡状排列。(2)第3代BMSCs的生长曲线呈‘S’形,经历了三个生长时期：潜伏期、对数生长期和停滞期。(3)流式细胞仪检测BMSCs表面抗原结果示：CD29+99.45%、CD34+1.45%、CD44+99.52%、CD45+1.41%。(4)成骨、成脂细胞诱导分化后,分别使用茜素红及油红‘O’染色,其中矿化结节被染成橘红色、脂滴被染成红色。结论全骨髓贴壁培养法分离、培养大鼠骨髓干细胞可获较高纯度的BMSCs,该类细胞具有向成骨细胞及脂肪细胞分化的潜能。目的观察外源性肝细胞生长因子(HGF)在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)促进原代星状细胞(HSCs)凋亡中的作用及其可能机制。方法复苏、传代SD大鼠原代HSCs,细胞增殖明显时用于实验。将实验分为以下4组：(1)HSCs空白对照组；(2)HGF组；(3)TRAIL组;(4)HGF+TRAIL组。各实验组细胞培养24h、48h。在倒置相差荧光显微镜下观察细胞形态。使用免疫细胞化学法了解alpha-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)在HSCs胞浆中的表达情况以及MTT比色法检测外源性HGF及TRAIL分别对HSCs增殖的影响；流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测HSCs凋亡率以及流式细胞仪免疫荧光法检测HSCs表面DR5的荧光强度；使用Western blot法检测HSCs的DR5蛋白表达。结果(1)免疫细胞化学法显示HSCs胞浆中a-SMA (+)。(2)MTT法结果显示：HGF及TRAIL分别在50-200ng/ml、0.5-1.5ug/ml各浓度下对HSCs增殖无影响,TRAIL在2ug/ml作用下对HSCs有抑制作用；24h、48hHSCs的OD值分别为：(0.22±0.02)%及(0.25±0.08)%,低于其它各组(P<0.01)。(3)流式细胞仪检测各组HSCs的凋亡结果示：HGF+TRAIL组的24h、48h的凋亡率明显高于空白对照组、TRAIL组及HGF组(P<0.01)。(4)使用免疫荧光法检测HSCs表面DR5的荧光强度结果示：HGF+TRAIL组24h、48h的DR5荧光强度明显高于空白对照组、HGF组及TRAIL组(P<0.01)。(5)Western blot法检测DR5蛋白的表达结果显示：HGF+TRAIL组中DR5蛋白明显高于空白对照组、HGF组及TRAIL组(P<0.01)。结论外源性HGF能促进TRAIL诱导的HSCs凋亡,可能与HGF能上调活化HSCs表面DR5蛋白表达有关。目的观察慢病毒介导HGF-ShRNA转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)及肝星状细胞(HSCs)后对BMSCs与HSCs共培养体系中HSCs凋亡的影响,探讨两种细胞来源的HGF在HSCs凋亡中的作用。为BMSCs移植治疗肝纤维化提供实验依据。方法采用全骨髓贴壁培养法对SD大鼠BMSCs进行分离、培养、纯化,使用传代至第3-4代的细胞进行实验。大鼠原代HSCs复苏、传代。应用6孔培养板,在半透膜(transwell insert)上接种BMSCs(1.3×105cells/well),在6孔培养板上接种原代HSCs(1×105cells/well),建立上下双层细胞共培养体系,常规培养。将实验分为以下5组：(1)空白对照组：HSCs单独培养；(2)BMSCs+HSCs共培养组：BMSCs与HSCs共培养；(3)HSCs转染共培养组：使用慢病毒介导的HGF-ShRNA转染HSCs后与BMSCs共培养；(4)BMSCs转染共培养组：使用慢病毒介导的HGF-ShRNA转染BMSCs后与HSCs共培养；(5)TNF-a预处理组：TNF-a(100ng/ml)预处理BMSCs6h后与HSCs共培养；以上体系培养观察24h、48h、72h。在倒置相差显微镜下动态观察活体细胞形态学改变及转染后绿色荧光表达情况；Western blot检测转染组HGF蛋白的表达；酶联免疫吸附法(ELISA)检测共培养各组上清液中HGF及TRAIL的浓度以及转染后各组上清液HGF的浓度；流式细胞仪检测转染后荧光表达及Western blot法检测HGF蛋白的表达。Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测HSCs凋亡率；荧光定量PCR、Western blot分别检测各组中DR5、Caspase-8mRNA及蛋白的表达。采用SPSS13.0统计软件进行数据分析。结果(1)质粒测序结果与构建时序列结果一致。(2)转染后72h在导致相差荧光显微镜下观察两种细胞绿色荧光表达量约80%；BMSCs转染组及HSCs转染组中HGF蛋白下调分别为(60.2±2.5)%、(63.3±4.3)%；流式细胞仪检测BMSCs转染组绿色荧光表达阳性率为70%。(3)ELISA法检测转染组上清液中HGF浓度结果显示：BMSCs空白对照组及HSCs空白对照组中HGF的浓度分别高于BMSCs转染共培养组及HSCs转染共培养组(P<0.01);(4)ELISA法检测共培养后各组上清液中HGF及TRAIL浓度结果提示：其中在TNF-a预处理组中HGF的浓度明显高于HSCs空白对照组、BMSCs+HSCs共培养组及BMSCs单独培养组(P<0.01)；TRAIL在BMSCs组中的浓度明显高于空白对照组、BMSCs+HSCs共培养组及TNF-a预处理组(P<0.01)。(5)流式细胞仪Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染法检测结果示：TNF-a预处理组HSCs的凋亡率明显高于其它3组,且呈时间依赖性(P<0.01);BMSCs转染共培养组中HSCs的凋亡率低于共培养组(P<0.05)。(6)FQ-PCR、Western blotting检测共培养后各组HSCs的DR5、Caspase-8mRNA、蛋白表达,其中TNF-a预处理组中HSCs的DR5、Caspase-8mRNA及蛋白表达量明显高于HSCs空白对照组、BMSCs+HSCs共培养组、BMSCs转染共培养组及HSCs转染共培养组(P<0.01)。BMSCs+HSCs共培养组中HSCs的DR5、Caspase-8mRNA及蛋白表达量明显高于BMSCs转染共培养组(P<0.01)。结论BMSCs来源的HGF通过上调HSCs中DR5及凋亡相关蛋白Caspase-8的表达促进HSCs的凋亡,而TNF-a预处理后能增强这一作用,HSCs自分泌的HGF在共培养体系中促进其凋亡中的作用甚少。