研究背景与目的:鼻咽癌是中国南方和东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一,多数患者发现时已进入晚期,有资料显示,Ⅲ～Ⅳ期患者占总数的85%左右。放疗联合化疗是治疗鼻咽癌的主要方法,但整体治疗效果仍然不尽人意,多数晚期患者仍因化学药物治疗失败而死亡,这很大程度归因于癌细胞产生多药耐药性（multidrug resistance。MDR）。肿瘤多药耐药是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后,该肿瘤未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。肿瘤细胞耐药的机制相当复杂,目前已知的包括:（1）药物的转运或摄取障碍;（2）药物的活化障碍;（3）靶酶质和量的改变;（4）增加利用内替的代谢途径;（5）分解酶的增加;（6）修复机制增加;（7）由于特殊的膜糖蛋白的增加,使药物更多被排出胞外;（8）DNA链间或链内交联减少。目前研究最多的是MDR-1基因以及由此基因编码的P-gp糖蛋白。但是根据以上机制研究的相应药物并不能有效解决肿瘤细胞耐药问题。最新观点认为肿瘤耐药性产生的本质是各种因素导致细胞凋亡机制的下调,细胞抗凋亡而逃避杀伤,研究者都试图寻找促进耐药肿瘤细胞凋亡的方法。抗肿瘤血管治疗是目前抗肿瘤治疗的热点,研究表明在大多数人类肿瘤中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）表达均上调,血管内皮生长因子可特异性作用于内皮细胞刺激新生血管形成,影响肿瘤的生长、转移和预后。针对VEGF的人源化单克隆抗体贝伐单抗（bevacizumab）2004年被美国FDA批准用于晚期结直肠癌的一线治疗,2007年进入晚期头颈部癌的一线治疗。临床观察到单用贝伐单抗无明显抗肿瘤活性,而与化疗联合以后甚至对一部份耐药的复发/转移病人有效。有理由认为贝伐单抗的抗肿瘤作用除了抑制肿瘤血管形成以外,还包括提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,而后者很可能是通过促进其凋亡来实现的。本实验目的在于:1.研究人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP的生物学特性。2.建立荷CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤模型。3.在细胞及动物水平研究贝伐单抗对CNE2/DDP细胞凋亡的影响。研究方法:1.人鼻咽癌低分化细胞系CNE2及其耐药细胞亚系CNE2/DDP培养于含10%小牛血清高糖DMEM培养基,培养条件为37℃5%CO₂饱和湿度孵箱。含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的完全消化液消化传代。流式细胞术测定细胞周期及细胞内荧光药物罗丹明的蓄积,测绘细胞生长曲线、计算倍增时间并在光镜下观察细胞形态,采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测CNE2和CNE2/DDP对顺铂、吉西他滨、5-氟尿嘧啶、长春新碱等4种常用抗肿瘤药物的半数抑制浓度(IC₅₀)和耐药系数（resistance index.RI）。2.取对数生长期CNE2/DDP细胞接种于96孔板,细胞密度为1×10⁵/ml,每孔100μl（10⁴个）。分1个空白对照组和5个实验组,每组6个复孔,实验组分别加入:贝伐单抗10μg/ml、顺铂0.1μg/ml、贝伐单抗10μg/ml+顺铂0.1μg/ml、顺铂0.2μg/ml、贝伐单抗10μg/ml+顺铂0.2μg/ml,培养72h,MTT法测定各组细胞存活率,进而计算药物杀伤率。对照组6个孔吸光度（OD）值取平均值,各实验组每孔吸光度值与该平均值的比值即为每孔的细胞存活率,1-存活率就是每孔药物的杀伤率。用公式表示:杀伤率=（1—实验组各孔OD值/对照组平均OD值）×100%。采用SPSS10.0软件中One-Way Anova方法分析各实验组药物杀伤率的差别。3.CNE2/DDP细胞常规培养于50ml培养瓶,镜下观察细胞呈贴壁生长后,分别加入顺铂0.1μg/ml、顺铂0.1μg/ml+贝伐单抗10μg/ml,1瓶CNE2/DDP作为空白对照,培养24h后收集细胞,Annexin V和碘化丙锭（PI）双染,流式细胞仪（FCM）检测各瓶细胞的凋亡情况。实验重复3次,采用SPSS10.0软件中Kruskal-Wallis H秩和检验分析不同处理方法间细胞凋亡的差异,P＜0.05为差异有统计学意义。4.在CNE2/DDP细胞培养液中添加贝伐单抗,终浓度为10μg/ml,每4天传代1次,连续传4代,得到细胞CNE2/DDP/Bev。用半定量RT-PCR方法检测MDR1、Bcl-2、Bax等基因在CNE2、CNE2/DDP、CNE2/DDP/Bev细胞内的表达,计算相对表达量。5.建立鼻咽癌耐药细胞CNE2/DDP裸鼠皮下移植瘤模型,将25只荷CNE2/DDP移植瘤裸鼠随机分成5组进行药物治疗（瘤直径至少为5mm）:①空白对照组（A组）:无菌生理盐水;②单药贝伐单抗组（B组）:5mg/kg;③单药顺铂组（C组）:4mg/kg;④联合1组（D组）:贝伐单抗5mg/kg+顺铂4mg/kg;⑤联合2组（E组）:贝伐单抗5mg/kg+顺铂2mg/kg,均为腹腔注射（0.5ml/只/次）,2次/周,连续用药4周。其中,经顺铂治疗组（C、D、E组）于用药前30分钟皮下注射赛格恩（3mg/kg）预防胃肠道反应。停药1周后处死各组裸鼠并称重,收集皮下移植瘤标本测量瘤质量,计算抑瘤率;免疫组织化学法（immunohistochemistry,IHC）检测各组移植瘤组织的微血管密度（microvesseldensity,MVD）,比较各组微血管密度的差异;RT-PCR进一步分析各组经药物治疗后MDR1、Bcl-2、Bax等基因的表达情况。各实验组数据应用SPSS10.0软件中One-way ANOVA方差分析,两两比较采用LSD法（Least-significant-Difference）分析,P＜0.05为差异有统计学意义。研究结果:1.经生长曲线计算出CNE2和CNE2/DDP的倍增时间分别为17.13h和23.13h。DDP对CNE2和CNE2/DDP的IC₅₀分别是0.03μg/ml和0.45μg/ml,RI为14.94,吉西他滨（gemcitabine,gem）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-FU）及长春新碱（vincristine,VCR）的RI分别为17.62、6.60及14.17,表明其具有多药耐药的特征,并且耐药性能稳定。流式细胞测定显示CNE2/DDP的G₀/G₁期细胞增多,S期细胞减少;CNE2/DDP内罗丹明的蓄积低于CNE2（3.56vs.220.35）。CNE2/DDP形态在光镜下变圆,大小不一,胞浆有较多颗粒。2.细胞杀伤结果显示:单用10μg/ml贝伐单抗时,细胞杀伤率与空白对照组相似（5.2%±4.3%Vs.0.0%±4.1%,户=0.180）。10μg/ml贝伐单抗分别与0.1μg/ml及0.2μg/ml DDP联合的杀伤率均高于单用DDP（42.3%±6.5%vs.34.4%±5.4%,P=0.041;62.6%±5.5%vs.50.0%±5.9%,P=0.009）。3.DDP联合贝伐单抗诱导的CNE2/DDP细胞凋亡:与对照细胞相比,经0.1μg/ml DDP或联合10μg/ml贝伐单抗处理24h后的CNE2/DDP细胞,出现明显PS外化现象,即FITC高染区而PI低染区的早期凋亡细胞增多（8.87%±1.06%Vs.3.25%±0.75%,38.20%±3.51%Vs.3.25%±0.75%）,FITC和PI均高染区的晚期凋亡及继发性坏死细胞增多（41.71%±9.78%vs.5.70%±0.43%,48.96%±6.90%vs.5.70%±0.43%）,而FITC和PI均低染区的活细胞减少。对照组及2个实验组间总凋亡率差异有显著性意义（P=0.027）,0.1μg/mlDDP+10μg/ml贝伐单抗组的总凋亡率（87.29%±3.38%）高于单用DDP组（50.58%±8.83%）。4.半定量RT-PCR方法检测显示CNE2、CNE2/DDP和CNE2/DDP/Bev中MDR1相对表达量分别为0.623、1.364和1.165,Bcl-2分别为0.613、0.952和0.135,Bax分别为0.665、0.387和1.751。5.治疗结束后顺铂常规剂量组（C、D组）裸鼠体重较其它各组均减轻（P＜0.001）,而其余各组之间体重无显著差异（P＞0.05）。与空白对照组相比,经联合用药组（D、E组）的移植瘤生长显著受到抑制,其抑瘤率分别为59.37%±3.29%、63.17%±3.05%,差异均有显著性意义（P＜0.001）,单药贝伐单抗和单药顺铂组抑瘤率仅为6.03%±4.68%、5.71%±8.30%,与对照组之间无显著差异（P=0.067,P=0.081）,两个联合用药组之间的抑瘤率也无差异（P=0.235）;经贝伐单抗治疗组（B、D、E组）的微血管密度表达下降（分别为13.60±1.11、12.80±0.90、13.22±1.02）,P值均＜0.001;RT-PCR结果亦显示,与空白对照组相比,贝伐单抗组和联合用药组（B、D、E组）Bcl-2 mRNA表达下调（P＜0.001）、Bax mRNA表达上调（P＜0.001）,但该三组之间无差异,实验各组之间在耐药基因MDR1 mRNA表达上均未见显著差异（P=0.918）。结论:1.贝伐单抗可以显著增加人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/DDP对顺铂的敏感性。贝伐单抗与顺铂联合时细胞杀伤活性最强,单用贝伐单抗杀伤作用不明显,联合用药时增加贝伐单抗浓度并不能提高杀伤率。2.贝伐单抗可以促进鼻咽癌顺铂耐药细胞CNE2/DDP凋亡。贝伐单抗联合顺铂所致凋亡率明显高于单用顺铂。3.贝伐单抗对耐药相关基因的影响不大,但可以显著影响凋亡相关基因的表达,促进耐药细胞凋亡。对于亲本的CNE2·细胞,当用顺铂诱导其耐药,再用贝伐单抗处理耐药细胞,其MDR1的表达先显著上调,再轻微下调;Bcl-2基因（凋亡抑制基因）的表达先上调再显著下调;Bax基因（凋亡促进基因）的表达先下调再显著上调。4.贝伐单抗对荷CNE2/DDP裸鼠移植瘤有显著抑制作用,同时提高CNE2/DDP耐药细胞对顺铂的敏感性,两者联合用药有显著的协同效应,其作用机制可能与抑制其微血管形成、诱导细胞凋亡有关。总而言之,VEGF单克隆抗体贝伐单抗可以通过诱导耐药鼻咽癌细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用。