研究背景及目的:肝纤维化是由慢性肝损害引起的一种动态、失衡的创伤愈合反应,其特征是细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的网状堆积,肝硬化是纤维化晚期的病理状态。全球肝硬化负担严重,抗纤维化研究已成为当前肝病领域的热点与难点。HSCs被认为是产生ECM的主要细胞群,其由静止的且贮存维生素A的状态到活化的且增殖的状态的转变代表了肝脏损伤的持续存在和纤维化的发生,在肝纤维化和肝硬化发生发展中扮演核心角色。增强对HSCs活化机制及纤维形成的理解有助于肝纤维化的早期诊断及潜在治疗靶点的揭示。高通量测序技术的出现为基于转录组学的关键分子的识别带来了前所未有的机遇。除编码RNAs外,nc RNAs亦参与调控HSCs的活化。鉴于肝纤维化的确切机制尚未建立且基于NGS技术的病人来源HSCs的转录组学研究尚无,本研究旨在展现人HSCs分离技术,并利用RNA-seq(RNA sequencing),对人HSCs的m RNAs及mi RNAs表达情况进行分析,以寻找与肝纤维化诊断与治疗相关的分子靶点。如今,组学研究正着眼于单个细胞的特征描述,为研究者带来潜在且意想不到的生物学发现。本研究旨在利用单细胞测序技术研究HBV相关肝硬化中细胞亚群的改变及潜在调控机制,揭示疾病本质。材料与方法:本研究采用IV型胶原酶循环灌流法从手术切除的肝组织中分离人HSCs,并利用维生素A的自发荧光特性、免疫荧光染色对HSCs进行鉴定。收集9例肝硬化及6例非肝硬化患者的HSCs,构成肝硬化-非肝硬化HSCs比较方案(非肝硬化HSCs作为对照),比较肝硬化与非肝硬化状态HSCs的m RNA组学差异。另外,将状态较好的新鲜分离的HSCs体外培养14天,获取7对初始及充分活化状态的HSCs,构成培养活化-新分离HSCs比较方案,以模拟肝纤维化过程,对比HSCs培养前后的基因表达差异。具体步骤如下:收集研究对象的人口学和临床特征,记录组织热缺血时间及细胞产率。对上述两个方案的HSCs进行RNAs提取、c DNAs文库建立及测序。对测序数据的基因表达水平进行计算并得到样本之间m RNAs的相关性及差异表达m RNAs(differentially expressed m RNAs,DEm RNAs),通过层次聚类分析确定不同样本中DEm RNAs的表达模式。对两个方案的差异表达基因(differentially expressed genes,DEGs)进行GO、KEGG、Reactome及Dis Ge NET等多种富集分析及数据一致性检验。利用蛋白质交互作用(proteinprotein interaction,PPI)网络寻找肝纤维化相关的关键基因(hub genes)并进行实时定量PCR(quantitative real time PCR,q RT-PCR)验证。选取4对体外培养前后的HSCs,收集患者及肝组织的基本信息。对HSCs进行RNAs提取、c DNAs文库建立及测序。计算mi RNAs表达水平及样本的相关性。对mi RNAs进行差异表达分析与层次聚类分析,并将本研究数据与公开发表的肝组织mi RNA-seq数据进行对比。利用q RT-PCR对肝病相关mi RNAs进行验证。预测差异表达mi RNAs(differentially expressed micro RNAs,DEmi RNAs)的靶m RNAs构建共表达网络并利用GO及KEGG分析对靶DEGs进行富集分析。初步分析mi R-1268a、mi R-665对肝纤维化的影响。采用循环灌流法及单细胞测序样本制备流程获取单细胞悬液。纳入4例HBV相关肝硬化肝组织及3例正常肝组织,在10x Genomics平台中形成单细胞Gel Bead in Emulsions(GEMs)结构。随后构建测序文库、测序、评估单细胞测序质量并生成细胞基因表达矩阵。经历细胞过滤后,对多个样本的表达矩阵进行校正、降维及聚类。利用细胞标志对不同群(cluster)的细胞进行定义。结果:本研究成功对人肝组织中的HSCs进行分离,细胞产率为105-106个/g。在mRNA-seq中,肝硬化与非肝硬化患者的性别及年龄分布、肝功能指标均衡可比。分析过程中1例肝硬化样本因聚类不符而被去除。最终,在硬化组织的HSCs中筛选到3,828个DEGs,分别有2,251、1,577个基因的表达水平出现了显著性上调和下调。培养活化-新分离HSCs比较方案纳入7对配对样本,排除了疾病基础及其他指标的干扰。HSCs被激活后m RNAs表达情况发生明显的改变,共鉴定出2,262个DEGs,包含1,032个显著上调的基因及1,230个显著下调的基因。两种比较方案的层次聚类分析均显示相同处理条件下基因的表达模式相近,且经典的肝纤维化相关基因可在差异表达谱中被验证。综合两种方案的生物信息学分析结果,DEGs参与ECM组成、小分子代谢等多种进程,并在粘着斑、视黄醇的新陈代谢、胶原或ECM生成、组装或降解等通路显著富集。PPI分析显示肝硬化-非肝硬化HSCs比较方案及培养激活-新分离HSCs比较方案的DEGs分别存在9,960、8,042对互作关系,COL1A1、COL1A2、VIM、MMP2、ITGB4、ITGA2、CDK1、HGF、CAV1、GSTP1、GNAI2、APP、SHC1、LPL、BCR、ESR1、CXCR4等17个基因被识别为肝纤维化的关键基因,包括与肝纤维化关系明确的基因(如COL1A1、MMP2、HGF等)及作用尚待明确的基因。q RT-PCR结果提示,在肝硬化发生时或HSCs被体外激活时,上述基因在转录水平发生改变,反映了HSCs在肝纤维化进展中的反应。根据mi RNA-seq分析可知,随着HSCs的激活,共鉴定到230个DEmi RNAs,包含118个上调的mi RNAs及112个下调的mi RNAs。从表达差异最为显著的mi RNAs中发现,mi R-758-3p、mi R-493-5p、mi R-409-3p、mi R-31-5p、mi R-1268a和mi R-381-3p等肝病相关mi RNAs亦可能在肝纤维化中扮演角色。其中,mi R-1268a拥有最丰富的靶DEm RNAs,在调控HSC活化过程中至关重要。将本研究的HSCs测序数据与公开的肝组织测序数据进行比较,let-7g-5p、mi R-101-3p、mi R-107、mi R-122-5p、mi R-127-3p、mi R-139-5p、mi R-148a-3p、mi R-192-5p、mi R-194-5p、mi R-215-5p、mi R-24-3p、mi R-26a-5p、mi R-340-5p、mi R-451a及mi R-99a-5p被证实在两组之间重叠。对表达模式矛盾的mi R-101-3p、mi R-192-5p和mi R-24-3p进行检测,结果与我们的数据基本一致。同时,mi RNAs-m RNAs共表达网络(|pearson相关系数|≥0.7,p<0.05)被描述,其由1,891对匹配的mi RNA-m RNA组成,代表了138个DEmi RNAs和1,414个DEm RNAs(mi R-665展现最强的联系性)。靶DEGs的集合参与胶原代谢、ECM结构组成、细胞骨架蛋白结合、细胞粘附等过程。在肝星状细胞系LX-2细胞中,沉默mi R-1268a或导入mi R-665模拟物可上调COL1A1的表达。基于单细胞内基因表达情况的差异,来自7例人肝组织的64,990个细胞被聚集成14个clusters,任一cluster均包肝硬化及正常对照肝组织的细胞。参考数据库对细胞初步分类及定义,肝细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核巨噬细胞、胆管上皮细胞、内皮细胞、间充质细胞、固有淋巴细胞(innate lymphoid cells,ILCs)及树突细胞(dendritic cells,DCs)等有9种细胞类型被鉴定。聚类热图显示clusters之间的基因表达情况呈阶梯状,差异清晰,在乙肝相关肝硬化中行使相应功能。结论:本研究建立的循环灌流法可充分消化肝组织并成功分离出人HSCs,为肝纤维化的机制研究奠定了基础。利用RNA-seq,本研究从m RNAs及mi RNAs水平揭示了人HSCs在疾病进程中或体外活化时的变化特点,为肝纤维化的诊断与治疗靶点的筛选提供依据及参考。本研究提及的hub基因及mi RNAs与HSCs激活或纤维化发生密切相关,可能成为候选生物标志物。此外,基于肝内不同细胞群体,本研究建立了HBV相关肝硬化的单细胞图谱。未来的研究将着眼于利用单细胞测序结果及相关分析以剖析肝纤维化的细胞和分子基础的未知领域,并提供研究肝纤维化治疗靶点所需的概念框架。