近年研究认为，cAMP是EP性发热的主要中枢介质，此外下丘脑中钙离子的浓度变化在发热中所起的作用也日益受到关注，但具体机制还不清楚。 TRPV4是瞬时感受器电位香草酸受体家族的成员之一，能被27℃以上的温热刺激激活，是一个非选择性阳离子通道，被激活时可产生较强的钙离子内流。研究发现TRPV4在下丘脑前部表达较多，这一区域是主要的体温调节中枢，表明TRPV4可能在体温调节中起一定作用。 本实验通过采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)复制大鼠发热模型，结合应用钌红(ruthenium red，RR)阻断TRPV4通道，观察发热时下丘脑组织中TRPV4表达、细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)变化及cAMP含量的变化，以探讨TRPV4在发热时是否参与体温调节过程。 材料与方法： 一、动物和手术 健康雄性SD大鼠48只体重200～250g，由中国医科大学实验动物中心提供，将大鼠随机分成4组，每组12只：对照组(N)、钌红组(R)、LPS发热组(L)和钌红+LPS组(R+L)。饲育室室温(22±2)℃，昼夜光照节律12h：12h，单笼饲养，自由进食水。在水合氯醛腹腔麻醉下，参照大鼠脑立体定位图谱，用立体定位仪向一侧侧脑室插入一外径为1mm的塑料管，用牙科水泥固定。测量体温时将数字温度计探头插入大鼠直肠内6cm处，待数值稳定后读数，以给药前1h测得的三次直肠温的平均值为大鼠基础体温。实验过程中记录大鼠体温(0～1h内每隔15min，以后每隔30min测量)。实验结束后检查插管位置，舍掉插管位置不正确的数据。 二、cAMP含量测定 在LPS致大鼠发热的高峰时间点断头取材，取下丘脑组织50mg，制成组织匀浆，离心，取上清按照cAMP放免测定方法检测。 三、细胞内钙离子浓度的测定 在LPS致大鼠发热的高峰时间点断头取材，取约1/4下丘脑组织，剪碎，在37℃水浴箱中用胰酶消化30min，小牛血清终止消化，Fura-2负载45min，离心，取沉淀，D-Hanks液定容至1ml，用双波长分光光度计测量细胞内钙离子浓度。 四、下丘脑组织中TRPV4表达水平 采用Western blot方法，取大鼠下丘脑组织，制成组织匀浆，离心，取上清进行蛋白定量之后，进行电泳，转膜，封闭，加抗TRPV4，抗体、二抗，DAB显色。 五、数据分析 采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有实验数据均用均数士标准差(-x±s)表示，各组均数间差异性的比较用t检验，相关分析用相关性检验分析法。 实验结果： 1、给与LPS后大鼠体温升高，在发热达高峰期(△T：1.21±0.02℃)，下丘脑TRPV4表达水平、[Ca2+]i及cAMP含量显著升高。 2、侧脑室单独给与钌红能使正常大鼠体温降低，下丘脑中[[Ca2+]i减少。 3、预先侧脑室给与钌红能明显抑制大鼠LPS性发热，同时下丘脑中TRPV4表达水平、[Ca2+]i及cAMP含量也相应减少。 讨论： 本实验通过给与大鼠腹腔注射外源性致热原脂多糖，建立了大鼠发热模型，并在此基础上检测了下丘脑中cAMP的表达量。结果显示，LPS致热大鼠下丘脑中cAMP的含量变化与体温变化值呈明显的正相关，进一步证实了cAMP是重要的中枢致热介质。为探讨TRPV4在体温调节中的作用，本实验在LPS发热大鼠模型中，结合应用TRPV4通道阻断剂钌红，观察了发热过程、发热时下丘脑组织中TRPV4表达、细胞内钙离子浓度变化及cAMP含量的变化。结果显示，与对照组相比，钌红+LPS组体温明显升高，但与LPS组比较其发热幅度降低，发热的潜伏期相应延长。而在钌红组观察到体温降低，与对照组相比有显著差异。提示TRPV4参与正常体温的维持，同时，在LPS致热过程中，参与体温升高的过程。 进一步的研究，我们又检测了在不同实验组TRPV4的表达量。观察到在LPS组下丘脑组织中TRPV4的表达在体温达高峰时与对照组相比明显增加，说明可能随着温度的升高，上调TRPV4通道的表达。而预先脑室内给予通道阻断剂-钌红，TRPV4表达量在钉红组和钌红+LPS组均低于对照组，说明钌红还具有抑制TRPV4表达的作用。 那么TRPV4是如何在LPS致热过程中发挥作用的呢?如前所述，TRPV4通道是一个非选择性阳离子通道，主要对钙离子具有通透性，被激活时可产生较强的钙离子内流。而钙离子是一种重要的中枢发热介质，因此我们推测可能是由于TRPV4通道的开放，使大量钙离子内流，进而使cAMP水平升高，使体温上升。为此，我们测量了不同实验组在发热高峰时[Ca2+]i浓度和cAMP含量。结果可见LPS组[Ca2+]i与对照组相比明显升高，同时cAMP含量与对照组相比也显著增加。而在钌红+LPS组，[Ca2+]i明显高于对照组，但与LPS组相比明显降低，cAMP含量也显著低于LPS组。 本实验结果提示，通过下丘脑TRPV4通道的表达和开放，影响[Ca2+]i水平，是维持正常体温和LPS致大鼠发热的重要途径。有关更直接的证明还需要进行电生理学等方面的深入研究。 结论： 1、TRPV4可能参与正常体温的维持。 2、通过TRPV4通道的激活，使钙离子内流增多，促进中枢发热介质cAMP产生增多，从而引起体温升高是LPS致大鼠发热的重要途径。