研究背景：慢性髓性白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)是一种造血干细胞克隆增生性疾病,具有肿瘤恶性克隆标志—Ph染色体,所形成的BCR-ABL融合基因具有异常激活的酪氨酸激酶活性,是导致慢性髓性白血病发生的根本原因。酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor, TKI)的出现具有里程碑式的意义,全面改善了CML的治疗效果,显著延长了CML患者的总生存(overall survival, OS)、无事件生存(event free survival, EFS)和无进展生存(progression free survival, PFS)。但随之出现的伊马替尼以及对其他二代、三代TKI的耐药,给CML的治疗带来了新的挑战。根据目前研究显示,TKI耐药机制主要包括两类：BCR-ABL依赖和非BCR-ABL依赖。BCR-ABL依赖的耐药机制包括：BCR-ABL融合基因异常扩增及表达上调或ABL激酶区的点突变；BCR-ABL非依赖机制包括：TKI摄入转运蛋白hOCT-1的低表达、多耐药基因MDR-1的过表达、a1-酸性糖蛋白的结合作用、其他信号转导通路异常激活、表观遗传学改变[4]。白血病干细胞学说成为补充上述耐药机制又一理论：处于静止期的白血干病细胞(leukemia stem cells, LSCs)对TKI不敏感,能够通过保存或克隆演变获得对TKI耐药的亚克隆群体,并在一定时间形成优势的耐药细胞群,最终导致TKI的耐药。慢性粒细胞白血病干细胞耐药的机制包括基因组的不稳定导致BCR-ABL基因的突变,BCR-ABL蛋白下游的激酶或不依赖BCR-ABL激酶的其他通路的异常激活以及TKI药物转运相关蛋白的上调或下调表达等。目前出现的治疗策略主要有：针对更广泛靶点以及BCR-ABL突变的TKI药物的更新,针对其他靶点的联合用药,还有靶向攻击白血病干细胞的药物。低氧作为一种重要微环境因素,在许多肿瘤微环境发病机制中的地位日益重要。低氧刺激下激活Hif-la通路,导致诸血管生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、纤维母细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)引起新生血管形成,利于肿瘤细胞的加速增殖,侵袭力增强。LSCs的静止状态的维持的关键因素之一就是低氧分压,Hif-1a相关的转导通路的启动,控制了LSCs的细胞周期程序,使干细胞处于GO期,对化疗及放疗的敏感度降低。Siah (Seven in absentia)是一类泛素连接酶家族,包括Siahla、Siahlb和Siah2.,参与Hif-la介导的低氧细胞信号通路。在低氧浓度刺激下,脯氨酸羟化酶(proline hydroxylase, PHDs)复合物分解为单体,PHD3与Siah2结合力提高,降解作用增强,从而使Hif-1a降解率减低,保证低氧条件下Hif-la的高浓度。在乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、胰腺癌等肿瘤的研究中证明：抑制或敲除Siah2基因,肿瘤的增殖力、侵袭力及耐药性都显著下降了,提示着Siah2可作为克服恶性肿瘤耐药的一个重要靶点。PYHL和维生素K3已被研究证实可作为Siah2的抑制剂,影响其下游的分子通路及生物学效应。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)作为骨髓微环境的重要组成成分,能够促进HSCs进入GO期维持骨髓造血干细胞的全能性,在低氧刺激下MSCs的Akt通路激活,利于其生存,促进其迁徙,并分泌VEGF、PGF、HGF促进组织在缺氧条件下的修复。MSCs可能通过某种机制与LSCs相互作用,作为微环境诱导的重要角色。基于上述研究背景,我们发现低氧微环境与CML对TKI的耐药之间的关系仍存在许多可探讨的问题。Siah2作为低氧相关信号通路的一个重要蛋白,是否参与了CML耐药的诱导?间充质干细胞作为微环境的又一重要因素是又是通过怎样的机制参与耐药?抑制Siah2是否可以逆转CML对TKI的耐药?这些问题引导本研究立足Siah2这一靶点,展开围绕低氧微环境与CML耐药机制的研究。目的：1.探索慢性髓性白血病原代细胞对TKI的耐药性与Siah2、Hif-1α所介导的低氧通路间的关系。2.探讨低氧引起的Siah2、Hif-1α的表达在慢性髓性白血病细胞株K562耐药株(K562-R)的变化规律。3.了解低氧刺激对K562-R细胞株细胞周期、凋亡、耐药性的影响。4.初步探究骨髓间充质干细胞与K562-R共培养加低氧刺激可能产生的协同生物学效应。5.通过维生素K3抑制Siah2的活性,进一步验证其对Siah2、Hif-1a相关的低氧通路及其生物学效应的作用。方法：1.检测人骨髓单个核细胞Siah2、Hif-la的转录及表达水平：自2011年2月至2013年12月于南方医院血液科诊治的18例慢性粒细胞白血病患者及5例造血干细胞移植供者的骨髓标本。18例诊断为慢性髓性白血病,其中8例为伊马替尼耐药患者；其他5例为正常造血干细胞移植供者。对他们的临床病历资料进行采集。用红细胞裂解液分离骨髓单个核细胞。从单个核细胞中提取总RNA：加入RNA-iso Plus混匀,静置,加入氯仿,静置,离心,吸取上清,加入异丙醇,离心,乙醇洗涤沉淀,加DEPC水溶解。RNA逆转录：配制RT反应液,加样放入PCR扩增仪,扩增程序：37℃15min,85℃5s。荧光定量PCR检测Siah2、Hif-1a的mRNA转录水平：引物设计,配制PCR反应用混合液,使用Real Time PCR扩增仪,进行PCR扩增反应。PCR扩增标准程序：一段激活步骤：95℃10min二段40个扩增循环：95℃/30s变性→55℃/lmin退火→72-C/30s延伸。有核细胞总蛋白提取：Ripa蛋白裂解液(含2ul PMSF)中,冰上放置,反复震荡,离心,取上清,测定浓度,加入上样缓冲液,煮沸变性。BCA法测定蛋白浓度。Western Blot检测Siah2、Hif-la蛋白表达水平：灌胶,上样,SDS电泳,转膜,封闭、抗体孵育,ECL化学发光及图像采集和分析。2.K562-R细胞株低氧刺激实验：K562-R分成3组分别在三气培养箱1%氧浓度培养Oh、24h、48h。PI染色流式细胞术测定各组K562-R细胞周期：细胞样品准备,固定,染色液配制,染色,流式细胞仪分析。Pyronin Y、Hoechst33342双染法检测各组K562-R GO期细胞：细胞样品准备,固定,染色液配制,染色,流式检测和分析。细胞计数盒(cell counting kit-8, CCK-8)检测伊马替尼对各组K562-R细胞的生长抑制率：96孔板培养细胞24h,按浓度梯度加药,培养箱孵育24h,加入CCK-8溶液,培养箱孵育1-4h,酶标仪测定吸光度。实时荧光定量PCR (real-time PCR, RT-PCR)检测各组K562-R Siah2、Hif-1a的mRNA转录水平。Western blotting检测Hif-la的蛋白表达水平。3.K562-R与骨髓间充质干细胞共培养实验：骨髓间充质干细胞分离：骨髓液提取有核细胞,弃去悬浮细胞,贴壁培养。将骨髓间充质干细胞按105/孔种于6孔板,用1.5μg/ml丝裂霉素处理48h后按106/孔种入K562-R细胞共培养72h以上。分为2组,分别在正常氧浓度下、1%氧浓度下培养48h。PI染色流式细胞术测定各组K562-R细胞周期。Pyronin、Hoechst33342双染法检测各组K562-R GO期细胞。CCK-8检测伊马替尼对各组K562-R细胞的生长抑制率。RT-PCR检测各组K562-R Siah2、Hif-la的mRNA转录水平。Western blotting检测Siah2、Hif-1a的蛋白表达水平。4.维生素K3处理K562-R实验：以0、5、15、30mM浓度用维生素K3处理K562-R72h,提取蛋白用western blotting法检测Siah2、Hif-1a的蛋白表达水平。在15mM浓度维生素K3处理下分别于0、24h、72h三个时间点用western blotting法检测Siah2、Hif-la的蛋白表达水平。以15mM浓度维生素K3处理K562-R分为两组分别于正常氧浓度、低氧1%氧浓度48h培养后,PI染色流式细胞术测定各组K562-R细胞周期。Pyronin Y、Hoechst33342双染法检测各组K562-R GO期细胞。CCK-8法检测伊马替尼对各组K562-R细胞的生长抑制率。Western blotting检测Siah2、Hif-1α的蛋白表达水平。5.统计学分析：采用SPSS17.0统计软件进行数据分析。目的基因ACT值,凋亡率、细胞周期百分比,若方差齐,运用单因素方差分析法,检验组间差异是否显著；若方差不齐,采用秩和检验。伊马替尼对K562-R增殖抑制率IC50计算用回归分析Probit法计算,比较IC50各组间差别用方差分析法。P<0.05时,差异具有统计学意义。结果：1.伊马替尼耐药的慢性髓性白血病患者较非耐药及正常骨髓的Siah2转录水平显著升高(P=0.001),Hif-1α转录水平无显著差异(P=0.668), Siah2、Hif-1α蛋白表达量明显升高。2.Siah2的转录水平在伊马替尼耐药的患者中与BCR-ABL突变的发生率相关(P=0.046,相关系数R2=0.571)3.随低氧刺激时间延长,K562-R凋亡率没有显著变化(P=0.16)；G2期百分比随低氧刺激时间延长下降(P=0.095),S期细胞百分比变化不显著(P=-0.095)。GO期所占细胞周期的比例显著上升(P<0.001)。4.K562-R在1%低氧0h、24h、48h的IC50分别是62.557±2.317uM、83.555±3.873uM、127.115±7.731uM(P=0.001)。5.1%氧浓度刺激48h Siah2的mRNA转录水平较低氧刺激前的水平显著降低(P=0.034), Hif-1α转录水平无统计学差异(P=0.459)。但Siah2、Hif-1α在K562-R蛋白表达水平随低氧刺激的时间的延长表达水平逐渐上升。6.与前面K562-R独立培养下正常氧浓度和1%氧浓度48h的两组细胞周期比较发现与MSCs共培养使细胞在正常氧和低氧的条件下凋亡率显著下降(P=0.038),共培养对细胞周期在G1/G0期、S期、G2期(P=0.660,P=0.642,P=0.978)的分布不产生影响。K562-R与MSCs共培养和K562-R独立培养相比,在正常氧浓度及1%氧浓度下GO期细胞比例显著上升(P=0.001)。7.K562-R与MSCs共培养在正常氧浓度、1%氧浓度48h刺激下IC50。分别是102.144±16.314uM、125.318±23.111uM。K562-R与间充质干细胞共培养组、K562-R独立培养组间的IC50无显著差异(F=4.951,P=0.057)；氧浓度与MSCs共培养间有显著交互效应(F=5.937,P=0.041)。8.K562-R独立培养、与MSCs共培养对Siah2、Hif-la的mRNA转录水平无显著差异(P=0.919,P=0.066)。Siah2、Hif-1a在K562-R蛋白表达水平随低氧刺激的时间的延长表达水平逐渐上升。9.K562-R在维生素K3梯度浓度(0、5、15、30mM梯度浓度刺激下)Siah2的蛋白表达量逐步递增,而Hif-1a的蛋白表达量依次递减。随着时间的递增(15mM浓度刺激下)Siah2的蛋白水平递增,Hif-1a蛋白水平递减。10.维生素K3(15mM)处理在不同氧浓度下对K563-R的细胞周期影响与对照组比较无显著差异。维生素K3(15mM)的加药组K562-R GO期细胞比例显著小于低氧浓度条件下的对照组(P<0.001)。11.维生素K3单独处理K562-R对IC50影响不显著(P=0.105),在1%氧浓度条件下,显著减少了因低氧条件引起的IC50的上升(P--0.012)。12.维生素K3(15mM)处理组在正常氧浓度及1%氧浓度48h刺激条件下均较对照组Siah2蛋白水平升高,Hif-1a蛋白水平降低。结论：1.Siah2的高表达与慢性髓系白血病对伊马替尼耐药可能具有一定联系。部分慢性髓性白血病耐TKI患者Siah2、Hif-1表达上调,提示其低氧相关通路可能为激活状态。而且Siah2的转录水平与慢性髓性白血病耐TKI患者中BCR-ABL突变呈一定相关性。2.低氧刺激能够使K562-R细胞的Siah2、Hif-1a蛋白水平上调,在促进的凋亡的同时,促进肿瘤细胞进入GO期,并减弱其对伊马替尼的敏感性。间充质干细胞可以促使K562-R细胞进入GO期,增强其对伊马替尼的耐药性,Siah2、Hif-1a的表达水平较独立培养时提高,但该差异在低氧条件下表现不明显。本研究认为低氧作为一个独立的耐药因素,通过Hif-1α相关通路,促进肿瘤细胞进入GO期,维持白血病干细胞的静止状态,以及通过激活其他耐药通路的方式介导CML的耐药；间充质干细胞作为微环境中另一因素也可以通过促进肿瘤细胞进入GO期的途径,介导CML耐药,可能同样通过Siah2、Hif-1α通路介导耐药。3. Vitamin K3能够抑制Siah2的作用下调Hif-1α的表达,对抗低氧效应引起的Hif-la上调,阻碍低氧引起的K562-R细胞进入GO期及对伊马替尼的耐药性的提高。上述事实揭示着Siah2可作为慢性髓性白血病耐药的重要靶点,以及Vitamin K3在慢性髓性白血病中可能具有拮抗耐药作用。