论文部分内容阅读
目的:气道黏液高分泌是各种慢性气道炎症性疾病重要的病理特征,气道黏液难以清除与其主要成分黏蛋白分泌增多、理化性质改变有关,本研究围绕黏蛋白及其水化,基于白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)诱导的H292细胞黏液高分泌模型,研究清热化痰法代表方药清气化痰丸对H292细胞黏液高分泌模型信号通路NF-κB/miRNA-494的调控作用,探讨清热化痰法化痰的部分分子生物学机制。方法:1建立IL-1β诱导的H292细胞黏液高分泌模型MTT检测不同浓度的IL-1β(1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)作用于H292细胞培养不同时间(6h、12h、24h、48h)对细胞生长的影响;ELISA检测不同浓度的IL-1β(1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)作用于H292细胞分别培养不同时间(6h、12h、24h、48h),黏蛋白MUC5AC、炎症因子白介素-8(IL-8)的含量;PCR检测不同浓度的IL-1β(2.5 ng/mL、5ng/mL、10ng/mL)作用于H292细胞培养24h时,MUC5AC mRNA的表达水平。2清气化痰丸对NF-κB/miRNA-494信号通路的影响根据模型筛选结果,实验设正常组、模型组、抑制剂组、清气化痰丸高剂量组、清气化痰丸低剂量组、黄芩苷组。ELISA检测各组黏蛋白MUC5AC和炎症因子白介素-8(IL-8)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的水平。PCR检测各组MUC5AC mRNA、CFTR mRNA、miRNA-494的表达水平。WB检测各组p65、IκB蛋白表达情况。结果1建立IL-1β诱导的H292细胞黏液高分泌模型1.1 IL-1β对H292细胞生长的影响与正常组比较,不同浓度的IL-1β作用于H292细胞分别培养6h、12h、24h、48h时,各组细胞OD值的变化均没有统计学意义(P>0.05)。1.2 IL-1β对H292细胞分泌黏蛋白及炎症因子的影响与正常组比,IL-1β作用6h时,IL-1β1.25ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组MUC5AC水平升高(P<0.05);12h时,IL-1β1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组MUC5AC水平升高(P<0.05);24h时,IL-1β1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组MUC5AC水平显著升高,且以IL-1β5ng/mL组最为显著(P<0.05);48h时,IL-1β1.25ng/mL、2.5ng/mL组MUC5AC水平升高,IL-1β5ng/mL、10ng/mL组MUC5AC水平降低(P<0.01),其余各组比较不具有统计学意义。与正常组比,IL-1β作用6h时,IL-1β1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组IL-8水平升高(P<0.01);12h时,IL-1β2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组IL-8水平升高(P<0.05)24h时,IL-1β1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组IL-8水平明显升高,且以IL-1β5ng/mL组最为显著(P<0.05);48h时,IL-1β2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组IL-8水平升高(P<0.05),其余各组比较不具有统计学意义。1.3 IL-1β对H292细胞MUC5AC mRNA表达的影响与正常组比较,不同浓度IL-1β干预H292细胞24h,IL-1β2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL组MUC5AC mRNA表达均明显上调,且以IL-1β10ng/mL组最为显著(P<0.05)。2清气化痰丸对H292细胞黏液高分泌模型NF-κB/miRNA-494信号通路的影响2.1清气化痰丸、黄芩苷对H292细胞生长的影响与模型组比较,清气化痰丸梯度浓度250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL组OD值明显升高,且以清气化痰丸1000μg/mL组最为显著(P<0.05);清气化痰丸2000μg/mL组OD值降低具有显著差异(P<0.05)。黄芩苷200μg/mL组、400μg/mL组OD值降低具有显著差异(P<0.05),其余各组比较OD值变化不具有统计学意义。2.2清气化痰丸、黄芩苷各组对H292细胞黏液高分泌模型黏蛋白与炎症因子水平的影响与模型组比较,抑制剂组培养上清中MUC5AC水平降低,胞浆内MUC5AC水平显著升高(P<0.05);清气化痰丸高剂量组培养上清及胞浆内MUC5AC水平均显著降低(P<0.05);清气化痰丸低剂量组、黄芩苷组培养上清中MUC5AC水平降低(P<0.05),其余各组比较变化无统计学意义。与模型组比较,抑制剂组IL-8分泌水平升高,TNF-α分泌水平均降低(P<0.01);黄芩苷组IL-8、TNF-α分泌水平均降低(P<0.05),其余各组比较不具有统计学意义。2.3清气化痰丸、黄芩苷各组对H292细胞黏液高分泌模型MUC5AC mRNA、CFTR mRNA、miRNA-494表达的影响与模型组比较,抑制剂组MUC5AC mRNA表达降低,CFTR mRNA表达升高(P<0.05);清气化痰丸高剂量组CFTR mRNA、miRNA-494表达明显升高(P<0.05);黄芩苷组CFTR mRNA表达明显升高(P<0.05),其余各组比较变化无统计学意义。2.4清气化痰丸对H292细胞p65、IκB蛋白表达的影响与模型组比较,抑制剂组、清气化痰丸高剂量组、清气化痰丸低剂量组、黄芩苷组P65蛋白表达均降低(P<0.05);抑制剂组、清气化痰丸高剂量组、清气化痰丸低剂量组、黄芩苷组IκB蛋白表达均升高(P<0.05)。结论1 IL-1β对H292细胞生长不具有抑制作用,能诱导H292细胞分泌炎症因子IL-8,能上调MUC5AC基因表达及蛋白分泌,可以选用5ng/mL IL-1β诱导H292细胞24h建立黏液高分泌模型。2.清热化痰法及其代表方药清气化痰丸并不能直接抑制黏蛋白MUC5AC的基因表达,但可以上调CFTR、miRNA-494基因表达水平,降低MUC5AC蛋白表达。3.清气化痰丸上调CFTR基因表达水平,降低MUC5AC蛋白表达的机制可能与NF-κB/miRNA-494通路关系并不密切。