扩展青霉Penicillium expansum是一种重要的植物病原真菌，它能够侵染上百种园艺作物，并诱发采后腐烂，造成巨大的经济损失。除了引起青霉病以外，P.expansum还能产生一种真菌毒素—棒曲霉素。棒曲霉素是一种有毒性的次生代谢物，它会随新鲜水果及其加工产品进入食品流通，对人体健康造成极大危害，因而受到世界各国的广泛关注。棒曲霉素的生化合成途径已经比较清楚，但是其生物合成的分子基础及调控机制仍不十分明确。因此，研究棒曲霉素的生物合成及其分子调控机制具有重要的科学意义和应用前景。本研究运用分子生物学、生物化学、代谢组学以及细胞生物学等方法，深入系统地研究了P.expansum棒曲霉素生物合成的分子基础及调控机制。研究结果包括以下几个方面:　　1.P.expansum棒曲霉素生物合成基因簇的克隆:从棒曲霉素合成途径的已知基因出发，通过SiteFinding PCR技术在P.expansum中克隆得到完整的棒曲霉素生物合成基因簇。基因簇全长41kb，由15个基因组成(PePatA～ PePatO)，其中9个编码合成途径的催化酶，3个编码转运蛋白(PePatA，C和M)，1个编码可能的转录因子(PePatL)，另外还有2个功能未知基因(PePatF和J)。通过与Aspergillus clavatus中的棒曲霉素合成基因簇进行比较，发现这两个基因簇在核酸和氨基酸水平上均具有较高的相似性，但是基因簇内各基因的排列顺序存在很大的差异。在有利于产毒（静置培养）和不利于产毒（振荡培养）的条件下对P.expansum棒曲霉素基因簇的表达情况进行研究，结果表明基因簇内15个基因的表达均与棒曲霉素的生物合成密切相关。　　2.棒曲霉素生物合成相关基因的功能验证:在P.expansum中建立了农杆菌介导的遗传转化体系，对基因簇内的15个基因进行了敲除，获得了每个基因的敲除突变株，并对各个突变株的生长、产毒及致病力进行了比较分析。结果发现，PePatM基因敲除后菌落的生长速度大于野生型菌株，而PePatI，J和K基因敲除后菌落生长速度变慢。PePatF基因敲除后孢子产量降低。另外，5个基因敲除突变株(PePatF，H，M，N和O)的菌落形态受到影响，合成并分泌大量色素类物质。在产毒方面，PePatE～L这8个基因的敲除突变株完全丧失了合成棒曲霉素的能力，PePatD，N和O基因敲除突变株的毒素产量不到野生型的2％，3个编码转运蛋白的基因(PePatA，C和M)被敲除后，毒素产量下降到野生型的0.9-39％。果实接种实验发现毒素合成能力的缺失不影响P.expansum对苹果的致病性，说明棒曲霉素不是P.expansum的致病因子。　　3.棒曲霉素生物合成相关蛋白的功能研究:通过对PePatE基因敲除突变株的代谢产物分析，发现该突变株大量积累棒曲霉素合成途径的中间产物E-ascladiol。利用异源真核表达系统对PePatE蛋白进行表达纯化，随后的体外催化实验表明PePatE可以将E-ascladiol催化生成patulin，证实PePatE催化棒曲霉素合成途径第10步反应。由于PePatE定位于细胞壁上，可以推测这一步反应发生于细胞外。通过对突变株进行底物添加，检测其代谢谱图的变化，推测PePatJ和PePatO可能参与棒曲霉素合成途径的第6步反应，PePatF催化第8步反应，PePatD催化第9步反应。此外，通过结构、定位及基因表达分析证明PePatL是棒曲霉素生物合成基因簇特异性的转录因子，可以通过控制基因簇内各基因的表达来调控毒素生物合成。　　4.环境因子对棒曲霉素生物合成的调控:比较了11种碳源、11种氮源以及6种不同的环境pH值对P.expansum的产毒能力以及棒曲霉素合成相关基因表达的影响。结果表明碳氮源类型对P.expansum的棒曲霉素产量均有显著影响。在以麦芽糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、蔗糖或可溶性淀粉作为碳源的培养基中，棒曲霉素合成量较高，有机复合氮源比无机氮源更有利于产毒，其中铵盐是最不利于毒素合成的氮源类型。研究还发现酸性环境比碱性环境更利于棒曲霉素的合成，P.expansum产毒的最适pH值为5.0。通过比较不同的环境因素下棒曲霉素合成相关基因的表达情况，证明环境因子对棒曲霉素生物合成的调控发生在基因转录水平。