研究背景多毛在激光整形科较为常见,常给患者带来严重的精神负担和心理压力,临床目前较为有效和常用的治疗方法为激光脱毛,激光整形科和皮肤科学者虽已对激光脱毛作了大量研究,但一般都停留在临床研究上,有关激光脱毛后组织学变化及分子机制的研究较少。为了寻找一种最适合的激光脱毛动物模型,科研工作者们已经研究了许多动物的皮肤结构,包括豚鼠、犬、猪等,在所有研究过的物种中,猪的皮肤结构是和人类最为相似的。西藏小型香猪作为中国独特的实验用小型猪种,具有体型小,遗传稳定,个体差异小等商品猪所不能比拟的优点,黑毛白皮的特征尤其适合作为激光脱毛动物模型。近年来毛囊生物学及毛发疾病的病理生理学正成为国内外生物学界、皮肤科领域、美容学科的研究热点。有关毛发的基础研究已取得了很大的进展,随着研究的深入,关于毛囊诱导和早期形态发生的分子机制逐渐明了,但对于毛囊生长周期精确的调控机制尚不清楚。其可能机制还涉及生长因子的调控。已证实有四大类调节因子对毛囊有直接作用,其中,TGF-β是目前研究较多且对毛囊发育比较重要的因子之一,对调控毛囊的形态学发生和周期性循环起着非常重要的作用,但迄今为止,TGF-β及其受体在激光脱毛这一特殊过程中的变化规律和作用机制国内外尚未见相关报道。我们提出假设:激光可使毛囊休止期延长、毛囊小型化或毛囊永久性破坏的原因:激光的光热作用、光机械、光压强等可能作为激动因素引起局部的炎症反应→分泌炎性因子作用于炎性细胞、成纤维细胞、角质形成细胞或黑色素细胞等→分泌TGFβ→抑制毛囊细胞增殖,促进毛囊角质形成细胞凋亡→达到脱毛作用。如果假设成立,促进毛发由休止期向生长期转变或延长毛发生长期从而延长生长周期均可延长毛发生长,反之则可治疗多毛。局部应用TGF-β拮抗剂有望治疗雄激素性脱发及其它脱发的治疗,应用其激动剂则可以治疗多毛症等生长期延长的毛发疾病。为开发治疗毛发疾病相关新药的研发提供参考。目的一、建立激光脱毛动物模型,研究激光脱毛后毛发数量的变化、毛囊及皮肤组织学改变和超微结构的改变及毛囊周期生物学变化。二、研究TGF-β及其受体在激光脱毛过程中的变化规律,探讨其在激光脱毛中的作用。第一部分建立激光脱毛动物模型并进行组织学研究方法动物实验选用4-6月龄黑毛白皮西藏小型香猪12只,按临床方法激光脱毛,肉眼观察治疗区术前、术后毛发的变化;在术前、术后即刻、1h及1、3、5、10、15、30、60天分别取材,常规HE染色,光镜观察毛囊及皮肤组织学改变及电镜观察超微结构的改变;RdUTP缺口末端标记法(Tunel法)检测毛囊细胞的凋亡情况;银染光镜观察和透射电镜观察激光脱毛前后毛囊黑色素含量的变化。结果肉眼观察治疗区术后出现红斑及不同程度的水肿,术后两个月毛发开始生长,但毛发明显变稀、变细(P＜0.001)。光镜观察激光治疗术后出现毛囊坏死、细胞凋亡,外根鞘及毛球部分细胞损伤明显,以术后1、3d达到高峰。术后5天毛囊的损伤性炎症减轻,术后10、15d表皮、真皮及毛囊结构基本恢复正常,术后60天毛囊数目减少,残余的毛囊结构正常。电镜观察激光治疗术后即刻、1h及1天时可见真皮乳头层水肿明显,毛细血管基底膜受损,内皮细胞肿胀,线粒体空化,管腔变窄;毛囊内外根鞘细胞胞浆内水疱形成,胞质内发生空泡样变,核染色质浓缩聚集,凋亡小体形成。外根鞘细胞核固缩,染色质聚集,核膜消融,粗面内质网明显扩张,线粒体肿胀,有嵴溶解,细胞间隙增大。提示内外根鞘细胞凋亡可能。毛球中基质细胞胞质内空泡化明显,细胞中及内根鞘角质处可见碎裂崩解的细小黑色素颗粒。毛球中上段可见破碎的黑色素颗粒散在于细胞周围。毛囊腔面毛根鞘细胞内见较多角质样颗粒,细胞表面见绒毛突起,毛皮质及髓质变形。病理改变以术后1天最明显。术后3天、5天可见毛囊各层上皮细胞核固缩,细胞凋亡,肿胀的细胞内和细胞间有散在的碎裂的黑色素颗粒,毛囊最内层角化物明显,外根鞘细胞线粒体空化,真皮鞘水肿明显,有淋巴细胞浸润。术后10天残余毛囊各层结构基本恢复正常,术后15天细胞基本恢复正常,术后30天及术后60天,残余毛囊各层组织及细胞正常。TUNEL法检测细胞凋亡可见:术前皮肤各层细胞、毛囊细胞结构正常,术后即刻、1h及1天可见少量表皮细胞及毛囊细胞胞核黄染,术后3天胞核黄染细胞增多,术后5天达高峰,10天后开始减退,15天时明显减退,60天与术前无明显差异。正常皮肤Massom-Fonata银染切片能清楚表现基底层的黑色素颗粒,向棘层方向黑色素颗粒逐渐稀少,真皮层中无黑色素颗粒沉积。毛干、毛囊毛母质及漏斗部细胞内可见黑色素颗粒。激光脱毛术后即刻Massom-Fonata银染切片可见表皮各层黑色素颗粒明显减少,毛干碳化,毛囊各层上皮细胞中可见碎裂崩解的细小黑色素颗粒。毛球中上段可见破碎的黑色素颗粒散在于细胞周围。术后第3天,Massom-Fonata银染切片,可见表皮基底层及棘层仍有散在细小黑色素颗粒,但无粗大颗粒。毛囊各层细胞内和细胞间有散在的碎裂的细小黑色素颗粒,但明显减少。术后第15天皮肤组织基本修复,Massom-Fonata银染切片可见表皮基底层及棘层仍有细小黑色素颗粒,以基底层明显,密度较术后第3天加强。毛囊各层细胞间未见黑色素颗粒。结论黑毛白皮西藏小型香猪可作为临床激光脱毛的良好的动物模型。激光照射后通过破坏毛囊和诱导毛囊直接由生长期直接进入退行期或静止期,达到脱毛的目的,与临床中激光脱毛治疗相符。本研究初步揭示了激光照射后毛囊组织的病理变化过程。认为激光不仅通过直接热凝固导致细胞坏死和诱导细胞凋亡两方面的作用造成毛囊的不可逆损伤,达到永久性脱毛的目的;而且激光脱毛后诱导毛囊由生长期直接进入退行期或静止期,毛发暂时停止生长,从而达到非永久性脱毛的目的。激光脱毛后毛囊组织中的黑色素含量进一步减少甚至消失,原因可能是激光照射后部分黑素细胞坏死和凋亡而残余的部分黑素细胞不再产生成黑色素颗粒。第二部分激光脱毛前后TGF-β异构体及其受体在激光脱毛后的表达研究方法将激光脱毛术前、术后即刻、1h及1、3、5、10、15、30、60天标本采用免疫组织化学方法检测TGF-β1、TGF-βR1、TGF-βR2蛋白表达情况,采用RT—PCR的方法检测TGF-β1mRNA、TGF-βR1 mRNA、TGF-β2 mRNA、TGF-βR2mRNA、TGF-β3 mRNA及TGF-βR3 mRNA表达情况结果免疫组化结果显示TGF-β1在激光脱毛前后猪毛囊中的表达:激光脱毛前TGF-β1蛋白颗粒主要分布于表皮角质形成细胞,表达较弱;激光脱毛后主要表达在毛囊外根鞘和内根鞘细胞。术后3天TGF-β1表达增强,术后5、10、15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。TGF-βR1蛋白颗粒主要分布于毛囊外根鞘。激光脱毛前表达较弱。术后3天TGF-βR1表达增强,术后5、10、15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。TGF-βR2蛋白颗粒激光脱毛前主要分布于表皮角质形成细胞,在毛囊结缔组织鞘中部分成纤维细胞和外根鞘细胞中有阳性表达,激光脱毛后术后3、5天在外根鞘部分细胞中有阳性表达,激光脱毛后术后10、15天在毛乳头基质细胞、外根鞘细胞中有强阳性表达,激光脱毛后术后60天在外根鞘部分细胞中有阳性表达,但明显减弱。RT—PCR结果显示激光脱毛术前、术后即刻、1h及1天TGF-β1 mRNA表达较弱,术后3天TGF-β1mRNA表达增强,术后5、10、15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1天TGF-βR1 mRNA表达较弱,术后3天TGF-βR1 mRNA表达增强,术后5、10、15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1、3天TGFβ2 mRNA表达较弱,术后5天TGF-β2 mRNA表达逐渐增强,术后15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1、3、5天TGF-βR2 mRNA表达较弱,激光脱毛术后10、15天TGF-βR2 mRNA表达逐渐增强,30天达高峰,60天时明显减退。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1、3天TGF-β3 mRNA表达较弱,术后5天TGF-β3 mRNA表达逐渐增强,术后15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1天TGF-βR3 mRNA表达较弱,术后3、5、10、15、30、60天TGF-β2 mRNA表达强阳性。结论激光脱毛前TGF-β1表达较弱,且主要分布于毛囊以外的角质形成细胞,激光脱毛后TGF-β1表达逐渐增强后再减弱,且主要分布于毛囊中,和毛囊细胞凋亡的步调相一致,因此我们认为激光脱毛后TGF-β1表达增强,促使残余毛发从生长后期向退行期转换,可能是通过抑制角质细胞增殖和诱导凋亡实现的;抑制毛囊细胞增殖,促进毛囊角质形成细胞凋亡,达到脱毛的目的。TGF-βR1主要分布于毛囊外根鞘,激光脱毛术前TGF-βR1表达较弱,激光脱毛后TGF-βR1表达逐渐增强后再减弱,和TGF-β1的表达相同,因此我们认为激光脱毛后TGF-βR1表达增强,促使残余毛发从生长后期向退行期转换,达到脱毛的目的。激光脱毛术前TGF-β2表达较弱,激光脱毛后TGF-β2表达逐渐增强后再减弱,和毛囊细胞凋亡的步调相一致,因此我们认为激光脱毛后TGF-β2表达增强,可能是通过诱导毛囊上皮细胞凋亡和内源性的细胞凋亡途径促进毛囊角质形成细胞凋亡从而促使残余毛发从生长期向退行期转换,达到脱毛的目的。激光脱毛后TGF-βR2在毛囊外根鞘细胞中表达逐渐增强后再减退,但略滞后于TGF-βR1,促使毛囊进入退行期,达到脱毛的目的。激光脱毛术前、术后即刻、1h及1、3天TGF-β3mRNA表达较弱,术后5天TGF-β3mRNA表达逐渐增强,术后15天达高峰,30天后开始减退,60天时明显减退。TGF-βR3在激光脱毛术后表达强阳性,可能在激光脱毛后毛囊从生长期向退行期转化的过程中起重要的作用。研究发现激光脱毛后TGF-β异构体及其受体在猪皮肤和毛囊中表达增强促进毛囊从生长期向退行期过渡,并抑制毛囊细胞增殖,促进毛囊角质形成细胞凋亡,从而达到脱毛的目的。