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农杆菌遗传介导转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation，ATMT)是获得丝状真菌突变体的有效方法之一，并得到广泛应用。尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）是引起河北省苹果再植病害的一种重要致病菌，为了解其生长发育以及分子致病机制。本研究采用农杆菌介导的T-DNA插入突变技术，对尖孢镰刀菌HS2菌株进行遗传转化体系的优化，以期获得转化效率较高的转化体系，从而建立尖孢镰刀菌的T-DNA插入突变体库，并对部分突变体的生长速率、产孢能力、致病力、插入拷贝数以及插入位点侧翼序列进行了分析研究，主要结果如下: 1.用携带绿色荧光蛋白、卡那霉素抗性基因以及潮霉素抗性基因标记的质粒pCamhybgfp的农杆菌LBA4404菌株对尖孢镰刀菌HS2进行农杆菌遗传介导转化，并对影响转化效率的共培养条件进行优化，所得到的遗传转化体系:将9mL浓度为106个/mL尖孢镰刀菌分生孢子悬浮液与等体积的OD600≈0.3的农杆菌LBA4404混合，取200μL混合液在含有200μmol/mL乙酰丁香酮(AS)的IM固体培养基进行19-22℃，48h的共培养。利用这一体系，每106个分生孢子能产生160-200个转化子。 2.利用以上优化的转化体系，建立了包含2440个突变体的突变体库。对其中300个突变体进行了PCR鉴定，并用荧光显微镜对突变体进行绿色荧光观察，其中283个突变体含有1000bp左右的目的条带并伴有绿色荧光，T-DNA整合效率达到94.33％。在对283株突变体进行遗产稳定性实验测定中，经过在PDA上5代继代培养，发现突变体仍可以在含潮霉素B的PDA上正常生长，证明外源基因已经插入到HS2基因组中并且能够稳定遗传。 3.对遗传稳定的突变体进行形态学、生长速率、产孢能力和致病力分析。与野生菌株HS2相比，在对223株突变体的致病力测定中，大部分突变体致病力变弱，其中突变体HS2-2109基本丧失致病力。从致病力缺失的突变体中，选取8株突变体进行Southern杂交分析，结果显示其中6株突变体为单拷贝插入，1株为双拷贝插入。 4.利用热不对称嵌套PCR(TAIL-PCR)对产孢量和致病力下降且为单拷贝插入的突变体分别进行了侧翼序列扩增，共获得了3条侧翼序列。经过分析，其中突变菌株HS2-100的右翼序列与尖孢镰刀菌假定蛋白的mRNA序列同源，HS2-100的左翼序列与层出镰刀菌D02945的des基因、P450-4基因和P450-1基因为同源序列，HS2-1107左翼序列与构巢曲酶FGSCA4c的Ⅷ染色体的2848590-2848704nt区域序列同源，而这3条基因的功能都需要进一步研究。 5.重测序结果表明突变菌株HS2-520T-DNA的插入位点在基因组的45604-45615nt处，该位置的基因未有功能注释，所编码的蛋白为假定蛋白FOC4_g10004604。突变菌株HS2-406T-DNA的插入位点在基因组的564331-564434nt处，该位点的上游基因为asp1基因，所编码的蛋白是二磷酸肌醇多磷酸水解酶aps1，位点为559622-563280nt处;它的下游为未知基因，所编码的蛋白是假定蛋白FOXB_06474，位点在566624-567793nt处。突变体HS2-2109T-DNA的插入位点在基因组的813838-814852nt处，它的上游基因是KIN4，所编码的蛋白是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶KIN4，位点在809998-813406nt处;它的下游基因是GWT1，所编码的蛋白是糖基磷脂酰肌醇-锚定壁转移蛋白1，位点在818858-820427nt处。 综合来看，本研究利用农杆菌遗传介导转化方法将T-DNA成功地插入到尖孢镰刀菌的基因组中，获得了一批基因被标记的突变体。尖孢镰刀菌突变体库的成功构建为研究尖孢镰刀菌转化子生长发育和致病机制奠定了基础，有利于对其功能基因的分析。结果表明，农杆菌遗传介导转化技术为在分子水平研究经济上重要的病原菌打开了新视角。