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研究鸡卵黄免疫球蛋白的分离纯化方法,为IgY替代哺乳动物血清IgG进行免疫学检测诊断研究奠定基础。同时,从卵黄分离WSF后的废渣中提取卵磷脂,以实现对鸡蛋的综合利用。
对3种IgY分离纯化方法进行比较研究,建立优化提取工艺。采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳进行IgY纯度分析,琼脂双向免疫扩散实验测定IgY效价,单向琼脂免疫扩散实验测定IgY含量。
①水稀释法结合盐析沉淀、离子交换色谱纯化IgY,确定最优条件为:卵黄液10倍水稀释,调pH至5.3,-18℃冻结6h,4℃解冻,添加3%硅藻土进行微滤(0.45μm混合纤维素酯膜),超滤(5万分子截留量聚醚砜膜)浓缩五倍,采用45%饱和硫酸铵盐析,沉淀重溶后经DEAE-SepharoseF.F.柱层析分离纯化,可从高免鸡蛋中得到电泳纯IgY,总活性回收率达到64.16%。
②水稀释法结合PEG沉淀提取IgY:卵黄液经水稀释-冻融微滤法去脂及超滤浓缩后,采用10%或12%PEG沉淀纯化IgY,可获得电泳纯IgY,IgY回收率达50%以上。
③水稀释-辛酸法结合冷乙醇沉淀提取IgY:卵黄液经水稀释法去脂,1%正辛酸沉淀去除残留脂肪及部分杂蛋白,经60%与30%冷乙醇分段沉淀,IgY回收率为39.02%,纯度为74.92%。
结果表明,水稀释-膜过滤法提取、盐析沉淀、离子交换色谱法纯化IgY,所得产品纯度和回收率均高于其他两种方法,且分离条件温和,对抗体活性影响小,对检测诊断用IgY而言,是较好的分离纯化方法。PEG沉淀法也不失为一种较理想的提取较高纯度卵黄抗体的纯化方法,可在室温下进行,并不易使蛋白质变性,操作简便、快速。采用辛酸提取结合冷乙醇沉淀纯化IgY,由于有机溶剂的使用,其对抗体活性有较大影响,而且溶剂耗用量大,并需要多步离心操作,制约了进一步工业化生产的应用。
嗜硫色谱作为一种新型蛋白质纯化技术,在抗体纯化领域有着广阔的应用前景。主要进行了其介质制备的基础研究,采用巯基乙酸反应检测介质活性基团含量,研究了介质制备过程影响偶联反应的主要因素,包括反应pH值、巯基乙酸浓度与反应时间等。
卵磷脂的提取纯化采用有机溶剂法,确定氯仿-甲醇提取和丙酮-乙醚-乙醇纯化工艺为:选择氯仿∶甲醇(1∶1.5V/V)为提取溶剂,滤饼与溶剂比为1∶4(W/V),室温下搅拌萃取30min,经pH8.34预冷(0℃)丙酮(粗磷脂∶丙酮=1∶2W/V)沉淀,再分别用乙醚和乙醇溶解,获得纯化的卵磷脂,产品用硅胶TLC分析,卵磷脂纯度较高,得率为8.14%。
通过实验方案,对卵黄免疫球蛋白不同分离纯化方法进行比较研究,优化建立了IgY提纯工艺,初步开展了嗜硫色谱纯化IgY其介质制备的基础研究工作。同时,采用溶剂法从提取卵黄抗体后的残渣中分离制备纯化卵磷脂,达到了对鸡蛋的综合利用,避免了分离WSF后卵黄残余物的浪费和对环境的污染。