衣原体(Chlamydia spp.)为一种严格细胞内寄生的革兰阴性菌,具有原体和始体两个独特的发育周期,在自然界广泛存在,可引起多种动物和人类的衣原体病。衣原体科包含1个衣原体属,下设11个种：肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、流产衣原体、家畜衣原体、鼠衣原体、猪衣原体、猫衣原体、豚鼠衣原体,以及2014年新确定的Chlamydia avium (C. avium)和Chlamydia gallinacea (C. gallinacea)。衣原体感染对畜禽养殖业造成巨大经济损失,同时还对动物产品的进出口贸易和人类健康等公共卫生安全领域产生重要影响。鹦鹉热衣原体长期被认为是禽衣原体病的主要病原,我国禽类衣原体的流行病学资料十分有限,世界范围内对衣原体新种(C. avium和C. gallinacea)的致病性和基因组学的信息知之甚少。本课题系统研究中国禽类(鸡、鸭、鹅和鸽)中的衣原体存在和流行现状,并对C. gallinacea的分离菌株开展致病性和基因组学研究。一、检测11个衣原体种FRET-qPCR方法的建立衣原体的检测方法主要包括病原分离培养、直接染色镜检、酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)、间接血凝试验(indirect haemagglutination test, IHA)、补体结合试验(complement fixation test, CFT)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)等。其中病原分离培养是衣原体检测的金标准,但耗时较长、灵敏度有限；ELISA方法特异性强,灵敏度高,但会与其它微生物之间发生交叉反应；IHA和CFT方法对设备要求低,但操作繁琐,灵敏度不高。血清学方法经常适用于批量样品的检测,但无法区分免疫接种和自然感染,可能造成假阳性。随着衣原体检测技术的不断发展,新型分子生物学方法是检测衣原体新的发展趋势。用于检测衣原体的PCR方法很多,包括普通PCR、多重PCR、巢氏PCR、荧光定量PCR等。荧光定量PCR方法是一种特异性强和灵敏度高的实时定量检测特定核酸技术,已广泛应用于多个衣原体种的检测,如肺炎衣原体、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、流产衣原体、家畜衣原体、猫衣原体等。目前已建立的PCR方法一般是针对某一个或几个衣原体种,但不能同时检测11个衣原体种。因此,本研究主要基于衣原体23S rRNA基因序列,建立了一种能同时检测11个衣原体种的FRET-qPCR方法；根据11个衣原体种产生熔解温度的不同而将其区分为8个组别,并对熔解温度接近的衣原体种进行测序证实。该方法特异性强,灵敏度高,是世界范围首次建立能同时检测并大致区分11个衣原体种的荧光定量PCR方法。二、中国禽类衣原体多样性研究本研究采集了全国24省活禽市场2,300个健康家禽的3,962份咽拭子和泄殖腔拭子,其中鸡、鸭、鹅和鸽的数量分别为1,791、179、115和215；咽拭子和泄殖腔拭子均采集的家禽有1,662个,仅采集咽拭子的有476个,仅采集泄殖腔拭子的有162个。应用本研究建立的衣原体FRET-qPCR方法进行检测,结合熔解曲线和测序分析鉴别衣原体种。研究表明,家禽中的衣原体总阳性率为26.2%(602/2,300),其中鸽的衣原体阳性率最高,达到49.3%(106/215),然后依次为鸡(24.7%,442/1,791)、鸭(24.0%,43/179)、鹅(9.6%,11/115)。不同地区衣原体阳性率差异较大,高于30%的有9个省份,四川省为最高,达到80.0%(56/70)；没有检出衣原体的5个省份包括山西、西藏、吉林、辽宁、上海；其它10个省份的衣原体阳性率为1.0%-26.0%。衣原体在咽拭子中的阳性率为22.0%,显著高于泄殖腔拭子中衣原体的阳性率16.1%；咽拭子和泄殖腔拭子均采集的家禽中衣原体阳性率为27.3%,其中两种拭子均阳性的家禽有162个,包括142个相同衣原体感染和20个双重感染。本研究从中国家禽中检测出5个衣原体种：C. gallinacea、鹦鹉热衣原体、家畜衣原体、猪衣原体和鼠衣原体。其中C. gallinacea和鹦鹉热衣原体为禽类主要的衣原体流行种,均从4种家禽中检出,前者占阳性家禽的61.7%(384/622),且主要来源于鸡,后者占阳性家禽的24.0%(149/622),但多数来源于鸽；家畜衣原体阳性样品仅3个,并且均来源于内蒙古地区鸡的咽拭子；猪衣原体和鼠衣原体分别占阳性家禽的10.5%(65/622)和3.4%(21/622)。本研究在世界范围首次从禽类检测出猪衣原体和鼠衣原体,并报道C. gallinacea为家禽的衣原体流行种,而鹦鹉热衣原体是鸽的衣原体流行种。三、三黄鸡自然感染衣原体的动态监测中国禽类衣原体多样性研究表明活禽市场的健康家禽可感染多个衣原体种,并且发现江西新干县某山村的三黄鸡携带4个衣原体种：鹦鹉热衣原体、C. gallinacea、猪衣原体和鼠衣原体。本研究对该地区的三黄鸡进行7个月的衣原体动态监测,分为9次采样：第1-3次在江西新干县某山村；随后鸡群转运至江苏省家禽科学研究所动物房,并进行第4-9次采样。第1-2次检测发现三黄鸡中衣原体阳性率分别为74.4%(35/47)和40.9%(36/88)；第3次检测后选取31只衣原体阳性的鸡转运至江苏省家禽科学研究所饲养：猪衣原体的阳性率达90.3%(28/31),其次为鹦鹉热衣原体6.5%(2/31)和C.gallinacea 3.2%(1/31)。第1-3次采样检测共发现4个衣原体种,其中猪衣原体为主要流行种,分别占衣原体阳性鸡的88.6%(31/35)、83.3%(30/36)、90.3%(28/31)。鸡群转运至江苏省家禽科学研究所动物房后,第4-5次检测表明衣原体的阳性率显著下降；第6-9次检测发现,猪衣原体和鹦鹉热衣原体完全消失,而C. gallinacea逐渐成为主要流行种,并且是唯一能检测到的衣原体种,这种感染状态一直持续到动态监测结束。此外,随机选取5只C. gallinacea阳性的鸡进行剖检,发现血液、咽拭子、泄殖腔拭子,以及7种脏器(气管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胰腺)均可检测到C. gallinacea的存在。本研究动态监测结果表明,猪衣原体和鹦鹉热衣原体随着周围环境的改变而逐步消失,但C. gallinacea阳性率上升并成为主要流行种。据此推测,三黄鸡感染猪衣原体和鹦鹉热衣原体可能只是暂时性的,而C. gallinacea很可能是鸡这种自然宿主的共宿体。四、Chlamydia gallinacea的分离鉴定及ompA基因的多态性分析本研究利用Hep-2细胞从C. gallinacea阳性的三黄鸡的1份咽拭子和3份泄殖腔拭子成功分离到4株C. gallinacea (JX-1、JX-2、JX-3、JX-4)。分离株的主要外膜蛋白A(ompA)基因序列经比对分析一致(GenBank登录号：KT692977),并且与C. gallinacea 08-1274/3株相应序列的相似度为85.7%(GenBank登录号：AWUS01000004).本研究检测为C. gallinacea阳性的拭子样品分别进行ompA基因可变区1-2和可变区3-4的PCR扩增及测序,将测序结果分别与GenBank中ompA基因序列进行多重比对分析,构建系统进化树。结果表明,C. gallinacea的ompA基因具有丰富的多态性,除GenBank已收录的ompA基因序列外,至少还存在13个新的血清型。目前,世界范围内仅仅从法国成功分离了1株C. gallinacea;本研究从江西新干县的三黄鸡中分离到4株C. gallinacea,新病原的分离鉴定将对深入研究C. gallinacea的致病性、宿主范围、传播机制以及潜在的人畜共患性意义重大。五、Chlamydia gallinacea对鸡胚致病性和肉鸡增重的影响本研究利用C. gallinacea JX-1株分别接种SPF鸡胚和AA肉鸡,观察其对鸡胚致病性和AA肉鸡增重的影响。鸡胚接种试验分为3个感染组和1个对照组,每组均为5个鸡胚。7日龄时,感染组接种200μl不同浓度的C. gallinacea (高、中、低剂量组分别为105、104、103基因组／μl),对照组接种200μl的SPG缓冲液,接种途径均为卵黄囊接种。结果在10到18日龄期间感染组鸡胚全部死亡,但死亡时间不规律,其中高剂量组鸡胚的病变较为严重,表现为胚体卷曲呈球形,全身出血,肝脏出血坏死、心外膜出血、肠道出血；经FRET-qPCR检测发现鸡胚卵黄膜、卵黄和尿囊液均有不同程度的C. gallinacea感染,其中卵黄膜含量最高(2x107基因组/mg),然后依次为卵黄(4x103基因组/μl)和尿囊液(2×103基因组／μl),而对照组的5个鸡胚均能正常生长发育至孵化出壳。将C. gallinacea JX-1株滴鼻方式接种于7日龄AA肉鸡,剂量为20 μl(105基因组／μl)。结果表明,感染组和对照组没有任何临床症状。7日龄AA肉鸡在接种前采集的拭子经FRET-qPCR检测均为阴性,两组之间体重没有显著差异；接种后前两周,感染组和对照组体重仍没有显著差异；而接种后第3到第5周,感染组体重显著低于对照组(883 ± 54 [SEM] vs.962±61 g,1,165±80 vs.1,315±93 g,1,539±120 g vs.1,645±133 g)接种后前两周,感染组每周增重率比对照组分别降低2.9%和5.2%,差异不显著；但接种后第3到第5周感染组每周增重率比对照组显著降低(8.2%,11.4%,6.5%；P<0.0009)。由此可见,C.gallinacea JX-1株对鸡胚有一定致病性,感染肉鸡虽不表现临床症状,但对肉鸡的增重有显著影响。六、Chlamydia gallinacea JX-1株的全基因组测序及比较基因组学分析本研究对新分离的C. gallinacea JX-1株采用第三代测序技术进行全基因组测序。由此,我们获得了世界范围第2个C. gallinacea全基因组序列。C. gallinacea JX-1株基因组大小为1.05Mbp, GC含量为37.93%；预测有957个基因,占基因组大小的91.21%;ncRNA包括39个tRNA,2个5S rRNA,1个16S rRNA,1个23S rRNA;有24个串联重复序列和37个散在重复序列；有1个10,815 bp的基因岛；没有发现前噬菌体、短回文重复序列以及次级代谢基因簇结构。C. gallinacea JX-1株通过与权威数据库比对分析,获得编码基因及其对应产物的功能注释。GO数据库有625个基因,KEGG数据库有576个基因,COG数据库有644个基因,Swiss-Prot数据库有469个基因。分泌蛋白的预测结果有26个,分泌系统蛋白预测有6个Ⅱ型分泌系统(T2SS)蛋白和39个Ⅲ型分泌系统(TTSS)蛋白,TTSS效应蛋白的预测结果有61个,其中2个效应蛋白编码基因GM000184和GM000192位于基因岛区域内。PHI数据库共筛选到17个表型突变基因,其中12个与毒力降低相关,1个毒力基因GM000417与致病性丢失有关。VFDB数据库中注释的38个毒力因子中有29个属于Ⅲ型分泌系统蛋白,1个属于Ⅱ分泌系统蛋白,其它毒力因子与C. gallinacea参考基因组序列基本一致。与11个衣原体种的比较基因组学分析表明,C. gallinacea JX-1株99.99%的比对区域与C. gallinacea参考株99.29%的比对区域相似度为99.33%-99.58%,C. gallinacea JX-1株96.85%的比对区域与C. avium 97.97%的比对区域之间相似度为53.06%-88.68%,但其与另外9个衣原体种的比对区域均低于40%,相似度为5.56%-37.24%,差异较大。所以,C. gallinacea JX-1株与C. gallinacea参考株基因组之间的共线性关系最好,亲缘关系最近,但与C. gallinacea参考基因组的结构变异分析发现,C. gallinacea JX-1株有1个126 bp的插入序列和1个大片段复杂的插入缺失区域；另外,更重要的发现是,C. gallinacea JX-1株的有些毒力因子与脆弱拟杆菌相似度极高,甚至完全一致,这说明不同物种进化过程中形成共有的毒力因子,在致病性方面发挥重要作用。综上所述,衣原体是一种可引起多种动物和人类感染的人畜共患病病原,在世界范围普遍存在,宿主范围广泛,但由于临床表现大多数不明显而未能引起足够重视。长期以来鹦鹉热衣原体被认为是禽衣原体病的主要衣原体种,但本研究从家禽中检测出5个衣原体种,完全改变了这种观点,其中C. gallinacea是禽类主要的衣原体流行种,在世界范围内首次报道从禽类检测出猪衣原体和鼠衣原体。我们成功地从三黄鸡的咽拭子和泄殖腔拭子中分离出4株C. gallinacea (JX-1、JX-2、JX-3、JX-4)。动物试验结果表明,C. gallinaceaJX-1株对鸡胚具有一定的致病性,并显著降低肉鸡增重率高达11.4%。此外,本研究采用第三代测序技术获得C. gallinacea JX-1株全基因组序列,也是世界范围第2个C. gallinacea全基因组序列,其基因组结构与仅有的1株C. gallinacea基本一致,但SV分析发现1个126 bp的插入序列和1个大片段复杂的插入缺失区域；更重要的发现是C. gallinacea JX-1株有些毒力因子与脆弱拟杆菌相似度极高,甚至完全一致。总之,中国禽类衣原体多样性及C. gallinacea基因组学研究将有利于更好地研究衣原体流行病学特点、遗传变异、致病机制、人畜共患传播的可能性,以及宿主与病原之间的相互作用,从而为深入了解其功能基因组学差异、逐步开展转录组学和蛋白质组学研究奠定理论基础和参考依据。