论文部分内容阅读
流行性感冒(简称流感)是由流感病毒(influenza virus)引起的急性呼吸道传染病。流感病毒能在短时间内突然爆发,造成不同程度地流行,且可以在各个年龄段的人群中引起发病。接种流感疫苗是预防和控制流感的最有效方法。传统以鸡胚为基质生产流感疫苗存在诸多不足,难以在短时间内为生产疫苗提供大量的鸡胚。用哺乳动物细胞生产疫苗具有很大的优势,细胞生产的过程更快,更容易质量控制以及更大规模的生产。Vero细胞是WHO推荐用于疫苗生产的细胞基质。无血清培养基是不需要添加血清就可以维持细胞在体外正常生长繁殖的合成培养基,其克服了含血清培养存在潜在污染源及不利于下游分离纯化等缺点。另外,微载体培养细胞增加了细胞和病毒的产量,使大规模生产成为可能。本实验首先采用传统的流感病毒重配方法,获得一株流感病毒Vero细胞适应株,然后在搅拌瓶中利用无血清微载体培养Vero细胞和流感病毒,通过对一系列培养条件的优化,从而得到了无血清微载体培养Vero细胞接种流感病毒的适宜条件。一、重配制备B型流感病毒Vero细胞适应株以流感病毒Vero细胞适应株B/Yunnan/02/2005Va(B)为母本株,与WHO推荐的2006-2008年疫苗株B/Malaysia/2506/2004共同感染鸡胚和Vero细胞,用抗血清B/Yunnan/02/2005Va(B)筛选重配病毒,在Vero细胞连传10代,空斑纯化重配流感病毒,继续在Vero细胞连传8代,血凝抑制试验、免疫荧光试验、单向免疫琼脂扩散试验表明重配病毒与B/Malaysia/2506/2004是同系,基因测序后分析证明含有B/Malaysia/2506/2004的HA和NA。从而筛选出一株B型流感病毒Vero细胞适应：B/Malaysia/2506/2004Va(B)。二、无血清微载体培养Vero细胞和B型流感病毒条件的优化在搅拌瓶中采用不同的细胞接种量和不同的微载体浓度培养Vero细胞并接种流感病毒,选择适宜的细胞和微载体浓度,并检测不同的pH值、TPCK-胰酶含量、病毒接种量、病毒收获时间及病毒收获方法,对流感病毒血凝滴度的影响。结果以1-5×105个／ml的Vero细胞接种至浓度为3 mg／ml的无血清微载体中,病毒培养液pH值为7.2,TPCK-胰酶含量为1.0μg/ml,病毒接种量为1.0 MOI,并在感染48h后补加TPCK-胰酶,培养72h后收获上清与细胞内病毒,超声破碎细胞获取病毒,血凝滴度可达1：512。从而获得了无血清培养基微载体培养Vero细胞和流感病毒的适宜条件。将无血清微载体得到的病毒制备灭活疫苗,免疫小鼠,免疫原性与重配前的毒株相比,差异无统计学意义。