脑卒中是当今社会威胁人类健康的主要疾病之一,缺血性脑卒中约占所有脑卒中的60-70%。目前,针对缺血性脑卒中的常规治疗手段有介入治疗、手术治疗和以神经功能恢复为主的康复治疗,这些治疗手段对改善脑卒中的临床症状有一定作用,但不能挽救已缺血坏死的脑实质细胞。近年来,以干细胞移植为代表的细胞替代疗法,成为治疗缺血性脑卒中的一个新方向。在各种干细胞类型中,神经干细胞(neural stem cells,NSCs)由于可直接分化为神经元、神经胶质细胞等多种脑实质细胞而在缺血性脑卒中的细胞替代和环路修复方面展现出了较好的发展潜力。脑缺血损伤可导致脑实质结构破坏,而脑实质结构破环又往往引起脑功能异常变化,因此缺血性脑卒中患者后期常并发焦虑、抑郁等一些精神障碍。正电子发射断层显像(positron emission tomography,PET)作为最具代表性的现代分子影像技术,能够从细胞和分子水平反映组织器官功能和代谢的变化,突破了传统影像学解剖结构显像的局限,对灵敏、无创地评价NSCs治疗缺血性脑卒中等神经损伤性疾病具有重要意义。由于可以灵敏地检测到脑功能的异常变化,PET分子影像还为进一步研究焦虑、抑郁等精神障碍提供了有效的技术手段。本研究针对NSCs移植治疗缺血性脑卒中,通过PET分子影像活体、动态地监测NSCs移植后脑缺血区域代谢的恢复情况,并结合膜片钳、病毒示踪等多种技术手段评价NSCs对脑内受损神经环路的修复情况。结果发现,NSCs不仅能很好地促进脑缺血区域的代谢恢复,还可与大鼠腹侧丘脑建立环路连接,从而在一定程度上修复缺血损伤的神经环路。另外,本研究针对缺血性脑卒中等其他神经损伤性疾病所伴随的一类精神障碍——惊恐型焦虑障碍,采用基于光遗传学联合PET分子影像的方法对特定脑区在惊恐发作中的作用进行了在体水平的评价。结果发现,光遗传学方法可精准刺激背侧导水管周围灰质区(dorsal periaqueductal gray,dPAG),在诱导大鼠惊恐行为发作的同时,还导致大脑多个区域出现了神经功能变化,提示这些脑区可能在惊恐发作的维持中发挥关键作用。综上所述,PET分子影像是一种活体、无创、灵敏地监测神经损伤修复与脑功能改变的有效方法,在评价治疗手段效果和研究发病机制等方面具有重要的影像可视化价值。第一部分基于18F-FDG PET分子影像疗效评价的大鼠脑缺血神经干细胞环路修复研究目的:本研究旨在通过 18F-FDG(2-[18F]-fluoro-2-deoxy-D-glucose)PET 分子影像活体、无创评价人源NSCs移植对大鼠局灶性脑缺血模型的治疗效果;结合免疫荧光、膜片钳联合跨突触病毒示踪的技术,进一步研究移植后的人源NSCs修复受损神经环路的情况。方法:本研究采用光化学诱导法建立特定脑区(躯体感觉皮层)梗死的大鼠缺血性脑卒中模型,通过磁共振成像(magnetic resonance imaging,MRI)确认梗死灶的位置和范围,将人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)来源的皮层定向分化的NSCs移植到梗死周边区。通过PET分子影像时空动态地活体评价N S C s移植后脑梗死区域代谢的恢复情况,同时利用活体生物发光成像(bioluminescence imaging,BLI)长期、动态地监测NSCs移植后的存活、增殖和分布等生物学行为。通过免疫荧光染色、膜片钳等手段评价NSCs移植后的分化、成熟等生物学行为,进一步利用病毒示踪技术研究NSCs与宿主腹侧丘脑建立环路连接的情况。结果:本研究利用光化学诱导法成功建立起一种局限于单侧躯体感觉皮层的局灶性大鼠脑缺血模型。PET研究结果表明,在局灶性脑皮层梗死后的第1天,损伤侧较健康侧躯体感觉皮层18F-FDG标准摄取值(standard uptake value,SUV)出现明显的降低(L/H=0.70)。在NSCs移植1周后,损伤侧躯体感觉皮层的代谢缺损出现明显的恢复(L/H=0.80),在NSCs移植的第4周,损伤侧躯体感觉皮层的代谢缺损恢复到最大水平(L/H=0.90)。BLI研究结果证实,随着移植时间的延长,NSCs在梗死区域的存活数量呈现逐渐增加的趋势。免疫荧光染色、膜片钳实验表明,NSCs移植2月后成功分化为大脑皮质各层神经元和胶质细胞,并且子代细胞表现出成熟的电生理特性(动作电位发放和自发突触后电流形成)。通过顺向跨单突触神经环路示踪病毒,进一步证实了在NSCs移植2月后,其子代细胞与宿主腹侧丘脑建立了直接的突触连接。结论:人iPSC来源的可定向分化为皮层的NSCs具有很强的存活和增殖能力,能有效促进局灶性脑缺血区域(躯体感觉皮层)的代谢恢复。NSCs能分化出正常大脑皮层的六层神经元,实现部分坏死皮层的细胞替代。NSCs具备高度成熟的电生理特性,可以与宿主腹侧丘脑建立突触连接,在一定程度上修复缺血受损的神经环路。第二部分 18F-FDG PET分子影像评价大鼠惊恐焦虑模型中光遗传刺激引起的神经功能变化目的:et惊恐障碍(panic disorder,PD)是一种临床常见的急性阵发性焦虑障碍,可单独出现,亦可由一些神经损伤性疾病(如缺血性脑卒中)引起,PD的病理生理机制仍不清楚。本研究旨在通过光遗传学刺激大鼠dPAG核团建立一个惊恐焦虑样模型,利用PET分子影像研究大鼠惊恐发作过程中相关脑区的神经功能变化。方法:本研究采用SD大鼠并分为两组:实验组大鼠注射AAV2/9-CaMKⅡα-ChR2-mCherry(ChR2+组,n=9),对照组注射 AAV2/9-CaMKⅡα-mCherry(ChR2-组,n=9)。在AAV病毒注射3周后,每组动物进行两次PET扫描,第一次PET扫描前不给予光刺激,第二次PET扫描前给予光刺激。通过对大鼠dPAG核团的兴奋神经元实施精确的光遗传刺激诱导惊恐焦虑样行为发作,进一步利用18F-FDG PET成像评价光刺激前后全脑水平的神经功能变化。最后,通过免疫荧光染色验证光遗传刺激前后dPAG核团c-Fos蛋白的表达情况。结果:光遗传刺激ChR2+实验组大鼠dPAG兴奋神经元可诱导出明显的惊恐焦虑样行为。即-FDG PET研究表明,ChR2+实验组dPAG、楔形核、小脑小叶、扣带回、海马伞、初级视觉皮层、下丘脑隔下核、后皮质颗粒皮层出现了葡萄糖代谢的显著增加(P<0.001),而基底节、额叶皮层、胼胝体、初级感觉皮层、初级运动皮层、次级视觉皮层和背侧膝状体则出现了葡萄糖代谢的显著降低(p<0.001)。免疫荧光染色的结果进一步表明,光遗传刺激ChR2+实验组dPAG核团可导致该区域c-Fos蛋白表达明显增加(P<0.001)。结论:本研究结果表明,dPAG在惊恐发作的产生中发挥关键作用,18F-FDG PET显像可用于在体可视化惊恐发作的相关脑区。18F-FDG PET联合光遗传技术将为研究特定脑区在脑疾病中的作用提供一种新的范式。