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目的：
在细胞水平，研究14-3-3γ蛋白参与内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制，即14-3-3γ蛋白是否将phospho-GSK3β靶向定位于胞浆完成对胞浆中β-catenin的调控，从而影响炎症因子的转录，进而起到内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。
方法：
我们采用的是H9c2心肌样细胞，并构建体外的缺氧/复氧损伤模型。将H9c2细胞分5组进行实验操作：Control(正常对照组)；A/R(缺氧/复氧组)；LPS+A/R(脂多糖+A/R组)；NC+LPS+A/R(阴性对照+脂多糖+A/R组)；siRNA14-3-3γ+LPS+A/R(siRNA14-3-3γ+脂多糖+A/R组)。
1.通过生物公司构建了三种具有基因序列高选择性的siRNA-14-3-3γ慢病毒，我们将带荧光(GFP)的阴性对照(negativecontrol，简称NC)病毒，首先感染H9c2心肌样细胞，然后在荧光倒置显微镜下观察NC荧光表达，进而筛选出病毒的复感染指数(MOI值)以及感染体系，并采用WesternBlotting法从三种序列中筛选出沉默效果最佳的病毒序列，完成对其的扩增便于后续实验的进行。
2.采用CCK-8试剂盒以及流式细胞仪双重筛选合适的LPS浓度，即内毒素耐受保护模型的建立；并用WesternBlotting法验证14-3-3γ蛋白在发挥内毒素耐受保护过程中表达量是否增加。
3.采用免疫共沉淀(Co-IP)检测在内毒素耐受保护心肌缺氧/复氧损伤过程中与14-3-3γ相互作用的配体蛋白，即GSK3蛋白亚型的确认。免疫荧光(IF)验证在内毒素耐受保护抗心肌缺氧/复氧损伤过程中14-3-3γ蛋白与其配体蛋白的亚细胞定位趋势是否一致。
4.WesternBlotting法观察β-catenin蛋白在不同干预下的表达情况，CCK-8试剂盒测定每组心肌样细胞的存活率；各组的细胞凋亡程度、活性氧(ROS)水平及线粒体膜电位的变化(Δψm)，均是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤进行操作，最后采用流式细胞仪上机检测；线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性也是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤操作，通过酶标仪上机检测；最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平。
结果：
1.筛选出siRNA-14-3-3γ慢病毒沉默效果最佳序列为Ywhag-RNAi(44876-1)，阴性对照组慢病毒对14-3-3γ蛋白无明显影响。慢病毒感染的最佳条件：MOI值为20，感染过程中所使用的最佳培养条件为含有10%FBS的DMEM培养基+HiTransGP，感染的最佳时长为72h。
2.经过CCK-8试剂盒以及流式细胞仪分别检测了细胞的存活率以及细胞凋亡程度，结果显示：当我们所使用的LPS浓度为200ng/mL时，在心肌样细胞缺氧/复氧损伤时出现较好的保护作用，也就说明了我们所建立的内毒素耐受保护模型以及体外的缺氧/复氧损伤模型是成功的。WesternBlotting结果显示LPS+A/R、NC+LPS+A/R这两组中的14-3-3γ蛋白含量有所增加，与我们前期实验结果相吻合。
3.利用免疫共沉淀(Co-IP)技术，IP：GSK3，IB:14-3-3γ检测到与14-3-3γ蛋白相互作用的GSK3蛋白的亚型为phospho-GSK3β，并且只有在LPS预处理下两者才会出现相互作用；免疫荧光结果显示在内毒素耐受保护心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中，phospho-GSK3β的亚细胞定位与14-3-3γ趋势一致，由细胞核向细胞浆转移，并且蛋白含量都有所增加。
4.与AR组相比，WesternBlotting检测结果显示：LPS+A/R、NC+LPS+A/R的β-catenin蛋白表达水平较高，表明在LPS预处理后β-catenin的蛋白浓度显著升高，进而完成在胞浆中的蓄积转移入细胞核影响炎症因子的转录；CCK-8试剂盒测定结果显示：LPS+A/R、NC+LPS+A/R的细胞存活率显著升高；细胞凋亡程度显著下降；活性氧(ROS)生成水平明显减少；线粒体膜电位变化(Δψm)较稳定；吸光度法测定线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度下降、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性下降；最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平明显减少。
结论：
内毒素耐受对心肌样细胞在经过缺氧/复氧损伤处理后确实存在保护作用，其机制是小剂量的LPS通过TLR4/PI3K/Akt途径去磷酸化GSK3蛋白，然后大量表达的14-3-3γ协助phospho-GSK3β完成胞浆内亚细胞定位，并进而对Wnt信号通路中的β-catenin蛋白进行胞浆内调控，使β-catenin免遭泛素-蛋白酶系统的降解而在胞浆中大量聚集，β-catenin蛋白含量在胞浆中增加后会促使其本身转移入细胞核并与胞核内的TCF/LEFs结合，调节大量炎性相关基因的转录，从而发挥保护作用。
在细胞水平，研究14-3-3γ蛋白参与内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的分子机制，即14-3-3γ蛋白是否将phospho-GSK3β靶向定位于胞浆完成对胞浆中β-catenin的调控，从而影响炎症因子的转录，进而起到内毒素耐受抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用。
方法：
我们采用的是H9c2心肌样细胞，并构建体外的缺氧/复氧损伤模型。将H9c2细胞分5组进行实验操作：Control(正常对照组)；A/R(缺氧/复氧组)；LPS+A/R(脂多糖+A/R组)；NC+LPS+A/R(阴性对照+脂多糖+A/R组)；siRNA14-3-3γ+LPS+A/R(siRNA14-3-3γ+脂多糖+A/R组)。
1.通过生物公司构建了三种具有基因序列高选择性的siRNA-14-3-3γ慢病毒，我们将带荧光(GFP)的阴性对照(negativecontrol，简称NC)病毒，首先感染H9c2心肌样细胞，然后在荧光倒置显微镜下观察NC荧光表达，进而筛选出病毒的复感染指数(MOI值)以及感染体系，并采用WesternBlotting法从三种序列中筛选出沉默效果最佳的病毒序列，完成对其的扩增便于后续实验的进行。
2.采用CCK-8试剂盒以及流式细胞仪双重筛选合适的LPS浓度，即内毒素耐受保护模型的建立；并用WesternBlotting法验证14-3-3γ蛋白在发挥内毒素耐受保护过程中表达量是否增加。
3.采用免疫共沉淀(Co-IP)检测在内毒素耐受保护心肌缺氧/复氧损伤过程中与14-3-3γ相互作用的配体蛋白，即GSK3蛋白亚型的确认。免疫荧光(IF)验证在内毒素耐受保护抗心肌缺氧/复氧损伤过程中14-3-3γ蛋白与其配体蛋白的亚细胞定位趋势是否一致。
4.WesternBlotting法观察β-catenin蛋白在不同干预下的表达情况，CCK-8试剂盒测定每组心肌样细胞的存活率；各组的细胞凋亡程度、活性氧(ROS)水平及线粒体膜电位的变化(Δψm)，均是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤进行操作，最后采用流式细胞仪上机检测；线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性也是通过购买相应试剂盒并按照说明书的步骤操作，通过酶标仪上机检测；最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平。
结果：
1.筛选出siRNA-14-3-3γ慢病毒沉默效果最佳序列为Ywhag-RNAi(44876-1)，阴性对照组慢病毒对14-3-3γ蛋白无明显影响。慢病毒感染的最佳条件：MOI值为20，感染过程中所使用的最佳培养条件为含有10%FBS的DMEM培养基+HiTransGP，感染的最佳时长为72h。
2.经过CCK-8试剂盒以及流式细胞仪分别检测了细胞的存活率以及细胞凋亡程度，结果显示：当我们所使用的LPS浓度为200ng/mL时，在心肌样细胞缺氧/复氧损伤时出现较好的保护作用，也就说明了我们所建立的内毒素耐受保护模型以及体外的缺氧/复氧损伤模型是成功的。WesternBlotting结果显示LPS+A/R、NC+LPS+A/R这两组中的14-3-3γ蛋白含量有所增加，与我们前期实验结果相吻合。
3.利用免疫共沉淀(Co-IP)技术，IP：GSK3，IB:14-3-3γ检测到与14-3-3γ蛋白相互作用的GSK3蛋白的亚型为phospho-GSK3β，并且只有在LPS预处理下两者才会出现相互作用；免疫荧光结果显示在内毒素耐受保护心肌细胞缺氧/复氧损伤过程中，phospho-GSK3β的亚细胞定位与14-3-3γ趋势一致，由细胞核向细胞浆转移，并且蛋白含量都有所增加。
4.与AR组相比，WesternBlotting检测结果显示：LPS+A/R、NC+LPS+A/R的β-catenin蛋白表达水平较高，表明在LPS预处理后β-catenin的蛋白浓度显著升高，进而完成在胞浆中的蓄积转移入细胞核影响炎症因子的转录；CCK-8试剂盒测定结果显示：LPS+A/R、NC+LPS+A/R的细胞存活率显著升高；细胞凋亡程度显著下降；活性氧(ROS)生成水平明显减少；线粒体膜电位变化(Δψm)较稳定；吸光度法测定线粒体通透性转换孔(mPTP)开放的程度下降、肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性下降；最后用酶联免疫吸附法(Elisa)检测炎症因子TNF-α以及IL-6的分泌水平明显减少。
结论：
内毒素耐受对心肌样细胞在经过缺氧/复氧损伤处理后确实存在保护作用，其机制是小剂量的LPS通过TLR4/PI3K/Akt途径去磷酸化GSK3蛋白，然后大量表达的14-3-3γ协助phospho-GSK3β完成胞浆内亚细胞定位，并进而对Wnt信号通路中的β-catenin蛋白进行胞浆内调控，使β-catenin免遭泛素-蛋白酶系统的降解而在胞浆中大量聚集，β-catenin蛋白含量在胞浆中增加后会促使其本身转移入细胞核并与胞核内的TCF/LEFs结合，调节大量炎性相关基因的转录，从而发挥保护作用。