水稻T-DNA插入突变体的筛选和SDP1基因功能分析

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目前,利用突变体克隆功能基因的方法被广泛采用。本研究采用正向遗传学方法克隆基因,即通过对水稻Enhancer trap系T1代T-DNA插入突变体的筛选,获得带有T-DNA插入的突变家系,通过分离突变家系侧翼序列,寻找侧翼序列与突变表型共分离家系,为基因分离与克隆奠定基础。并对一个半矮、晚抽穗、叶色淡绿突变体sdp1(semi-dwarf,delayed flowering,pale green 1;相应功能基因SDP1)的基因功能和农艺性状进行了初步研究,主要实验结果如下:1.2005年对T-DNA插入突变体T1代约2,000个家系筛选,结果显示:苗期和大田总突变频率分别为4.40%、13.42%,主要突变表型有:白化、黄化、假病斑、矮化,少分蘖、株型披散、早衰、晚抽穗等。并对突变家系进行了T-DNA插入和突变表型的初步共分离检测,得到126个表型明显PCR阳性家系。通过TAIl-PCR、反向PCR、质粒拯救等方法,总共分离侧翼序列142条,对这些序列进行了Blastn分析和侧翼序列与突变表型的共分离验证。2.对sdp1突变体侧翼序列进行生物信息学分析,确定T-DNA插入在第3染色体,目标基因SDP1(OS03g63050)功能未知,该基因全长809 bp,包括3个外显子,T-DNA插入在此基因终止密码子后8 bp。对T3代进行遗传稳定性分析,证明了侧翼序列与突变表型仍是共分离的。通过Southern杂交,得出sdp1突变体是T-DNA单拷贝插入。对互补载体(陈志辉构建转化)植株T0代进行表型观察和检测,结果表明表型恢复率(野生型SDP1基因能恢复sdp1突变体的表型)为24.36%,从而对SDP1基因的功能进行了验证。通过对Enhancer trap载体(pFX-E24.2-15R)上GUS基因染色,观察到GUS在突变体的苗期、分蘖期、抽穗期的根、茎、叶、叶鞘及颖花的外稃均有表达。RT-PCR未检测到SDP1基因在苗期、分蘖期、抽穗期的根、茎、叶、叶鞘等部位的表达。构建成pSDP1∷GFP的融合表达载体并转化中花11。对抽穗期的色素含量进行了测定,结果表明突变体叶色淡绿是由于Chl含量的下降及Car含量的升高引起的。对中花11、sdp1野生型、杂合体和突变体生长的各个时期进行株高的测定,得出四者株高随时间变化的趋势,确定SDP1基因对发芽后23天的植株株高已产生影响。并对中花11、sdp1野生型、杂合体和突变体主要农艺性状进行考种,结果表明野生型与突变体在株高、结实率、千粒重等方面都存在明显的差异,第一二茎节长度的变化是引起株高差异的主要原因。
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