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固有免疫应答是机体抗感染的第一道防线,在宿主受到感染的早期阶段起至关重要的作用,其主要是通过中性粒细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞等多种免疫细胞的协调作用实现的。在这些免疫细胞上可表达多种模式识别的受体,如:Toll蛋白样受体(TLR)、G-蛋白偶联受体、甘露糖受体、Fc受体等,这些受体识别并结合病原体,从而介导效应细胞发挥免疫作用。除上述受体外,效应细胞还能表达另一些模式识别受体家族,此类受体往往同时包括激活受体和抑制受体。髓样细胞表达的激发受体(triggering receptors expressedby myeloid cells,TREM)就是这种类型的受体。Trem-Like Transcript 2(TLT-2)基因是近几年倍受关注的TREM家族成员之一,主要表达于B细胞、T细胞以及巨噬细胞上。目前,关于TLT-2功能和生物学特性的研究较少,尤其是人TLT-2分子的免疫学功能。在小鼠的研究中发现,TLT-2作为共刺激分子对T细胞有着重要的调节作用。然而,关于人TLT-2分子的生物学特征及其功能尚待研究,同时至今尚无商品化单抗。本课题研究旨在通过克隆人TLT-2全长基因,建立基因转染细胞株L929/TLT-2,并以此细胞株为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,研制鼠抗人TLT-2单克隆抗体,并以L929/TLT-2基因转染细胞和鼠抗人TLT-2单克隆抗体为工具,研究人TLT-2分子的生物学特性及其功能。一、人TLT-2基因的克隆、PIRES2-EGFP-TLT-2表达载体的构建、L929/TLT-2基因转染细胞株的建立[目的]:从人全血cDNA文库中克隆TLT-2编码区全长基因,建立能稳定表达人TLT-2分子的基因转染细胞株,为研制鼠抗人TLT-2单克隆抗体提供免疫原。[方法]:RT-PCR从人全血cDNA文库中克隆出人TLT-2编码区全长基因,经Xho I和BamH I双酶切后插入PIRES2-EGFP真核表达载体中,构建成PIRES2-EGFP-TLT-2重组载体,以脂质体法重组载体PIRES2-EGFP-TLT-2转染鼠L929细胞,经G418长期加压筛选获得基因转染细胞L929/TLT-2。流式细胞术、RT-PCR及Western-blot分析重组载体在基因转染细胞中的转录与反应?。[结果]:测序结果表明,获得的全长人TLT-2全长基因与Genbank的基因序列完全一致。通过Xho I和BamH I双酶重组载体,能够释放出956bp的目的基因片段;流式细胞术检测基因转染细胞株L929/TLT-2细胞膜表面能稳定表达绿茵光蛋白(GFP)。RT-PCR及Western-blot法分别从基因和蛋白水平检测到基因转染细胞中人TLT-2分子的表达。二、鼠抗人TLT-2单克隆抗体的研制及其生物学特性鉴定[目的]:研制鼠抗人TLT-2单克隆抗体为探讨人TLT-2的分子特性及其对T细胞的生物学作用提供必备的物质手段。[方法]:以高表达人TLT-2基因转染细胞L929/TLT-2为免疫原,常规免疫小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,以L929/TLT-2作为抗体筛选细胞,L929/mock为对照细胞,经间接免疫荧光标记和流式细胞术分析、反复筛选和多次克隆化培养,筛选出分泌特异性鼠抗人TLT-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株;采用细胞核染色体计数、Ig-亚型快速定性试纸法,竞争结合抑制以及IP和Western-blot等试验,对获得的杂交瘤进行生物学特性的鉴定,通过流式细胞术分析TLT-2在固有免疫细胞和人肿瘤细胞株表面的表达情况,通过CCK8和ELISA测定单克隆抗体在体外对T淋巴细胞增殖及细胞因子分泌的影响。[结果]:获得一株稳定分泌鼠抗人TLT-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为8C10。经体外连续培养半年以上,液氮冻存后复苏,细胞的生长状态良好,分泌抗体的性能稳定,染色体数目分析,杂交瘤细胞株的染色体在100条以上,大于鼠的染色体数目,表面为融合体;经亚型快速试纸条分析显示,单抗轻链为κ链,重链为IgG1;IP和Western-blotting分析显示,单抗8C10与商品化多抗识别的为同一分子,大约55KD大小的蛋白质;抗原位点竞争抑制实验提示单抗8C10与本所研制的另一株鼠抗人单克隆抗体10F5识别细胞抗原结合位点不同;8C10与固有免疫细胞作用显示,TLT-2在单核与B细胞表面组成性高表达,在静息T细胞和经anti-CD3mAb活化的T细胞上有弱表达;对8C10生物学功能的研究结果提示,该单抗能够在体外显著抑制T细胞的增殖和细胞因子的分泌,是一株具有较好效应的功能性单克隆抗体。[全文讨论]:本课题成功研制出能稳定表达人TLT-2的基因转染细胞L929/TLT-2,并在此基础上研制出能稳定分泌特异性鼠抗人TLT-2单克隆抗体的杂交瘤细胞株。上述结果,为进一步研究TLT-2分子介导的信号通路及其在疾病中的作用提奠定了物质基础。