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目的:研究肝细胞癌、癌旁及正常肝组织中Mcl-1的表达及其临床意义,探讨RNA干扰下调Mcl-1对肝癌细胞生长与药物敏感性的影响,通过研究GCDA对肝癌细胞存活与耐药的作用和可能途径,阐明抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌发生中的作用,分析GCDA调节Mcl-1产生抗凋亡作用的机制,以利于进一步研究新的策略联合靶向Mcl-1,开发肝细胞癌治疗的新方法,开创肿瘤分子靶向治疗的新途径。方法:1.采用免疫组化S-P法检测51例肝细胞癌组织、49例癌旁组织和25例正常肝组织中Mcl-1的表达,并结合临床病理特征进行分析。2.采用免疫荧光法检测GCDA作用前后细胞内蛋白表达强度与细胞内定位的变化。3.用阳离子脂质体LipofectamineTM 2000为载体将Mcl-1 siRNA转染至HepG2细胞中,对细胞内Mcl-1基因表达进行干扰。4.采用MTT法检测GCDA±抗肿瘤药物或抗肿瘤药物±Mcl-1siRNA处理前后肝癌细胞的相对活性与增殖性。5.采用流式细胞分析法检测抗肿瘤药、GCDA或Mcl-1 siRNA作用前后细胞周期的变化。6.GCDA±抗肿瘤药物或抗肿瘤药物±Mcl-1 siRNA处理肝癌细胞,Annexin V-FITC和PI合染细胞,荧光显微镜和电镜观察凋亡形态学改变,流式细胞分析法检测细胞凋亡率的变化。7.采用免疫沉淀法检测GCDA作用下Mcl-1与促凋亡蛋白间的相互结合。8.提取各方案的细胞总蛋白,采用BCA法检测蛋白浓度,Western Blotting技术检测细胞内待测蛋白的表达变化,β-Tubulin为内参,蛋白带灰度值采用BandScan软件进行分析。9.采用Comet Assay在单细胞水平上检测GCDA作用后DNA链损伤的情况。结果:1.抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌组织和癌旁组织中均有表达,阳性率分别为68.63%和58.10%,与正常肝组织的8.00%相比,差异具有显著性（p＜0.01）。细胞内定位以胞浆为主,部分出现胞核表达。其表达与临床病理特征如性别、年龄、HBV感染、肿瘤大小、肝硬化及病理分级无相关性（p＞0.05）,高分化肝细胞癌有较高的阳性表达率（67.86%）。2.RNA干扰结果显示Mcl-1 siRNA转染24h、48h、72h后Mcl-1蛋白表达明显减少,与未转染组有明显差异（p＜0.01）,尤以48小时表达最弱,其灰度值仅为未转染时的27.70%。Mcl-1下调后HepG2细胞中抗凋亡蛋白Bcl-xl表达相应减少,而促凋亡蛋白Bak、Bim和Bax表达稍有增多。3.MTT结果显示GCDA在短时间内对肝癌细胞株HepG2细胞有增殖作用,以10～20min最明显（p＜0.05）;其浓度在200μM内对细胞有增殖作用,以50～200μM处最明显（p＜0.05）。RNA干扰下调Mcl-1后HepG2细胞在抗肿瘤药物作用下的存活率明显低于单纯药物组的存活率（P＜0.05）。4.流式细胞仪检测结果显示GCDA与转染载体本身对细胞周期与凋亡无明显影响（p＞0.05）,RNA干扰下调Mcl-1后HepG2细胞在药物作用下的凋亡率（33.17%）高于单纯药物组的凋亡率（17.60%）（P＜0.05）。5.免疫荧光结果显示GCDA能使细胞内Mcl-1和pERK表达明显增强,核内表达逐渐加强。Irinotecan处理后pERK和Mcl-1的表达稍有减弱,尤以核内明显。6.免疫沉淀结果显示GCDA作用后Bak与Bim结合减少,Bim、Bak与Mcl-1结合增加。7.Western Blotting结果显示GCDA能使HepG2细胞中抗凋亡蛋白Mcl-1表达明显增加,促凋亡蛋白Bim、Bak和Bax表达减少。蛋白合成抑制剂使Mcl-1表达在2-3小时开始衰减,在GCDA存在情况下,Mcl-1在6小时的表达仍很强。Irinotecan处理后pERK和Mcl-1的表达被抑制,在GCDA存在情况下两者表达明显回升。8.Comet Assay检测结果显示随着GCDA作用浓度的增加HepG2细胞中DNA链损伤程度加重。Western Blotting显示DNA修复蛋白PARP明显增强。结论:1.抗凋亡蛋白Mcl-1在肝细胞癌组织中呈过表达状态,在肿瘤发生过程中呈逐渐增强的趋势,高分化肝细胞癌就有较高的阳性表达率,提示肝细胞癌的发生与Mcl-1的抗凋亡作用有关。2.RNA干扰能有效降低肝癌细胞中Mcl-1蛋白表达水平,Mcl-1蛋白的特异性下调能增加化疗药物作用后肝癌细胞的凋亡率,增强肝癌细胞的药物敏感性。当Mcl-1蛋白水平下调后,与Mcl-1同源的Bcl-2家族抗凋亡成员的功能受到部分抑制,促凋亡蛋白Bax、Bim和Bak功能增强,诱导细胞凋亡。3.GCDA能诱导肝细胞癌细胞存活与耐药,其作用可能是通过上调抗凋亡蛋白和下调促凋亡蛋白来实现的。4.GCDA能使肝细胞癌细胞中Mcl-1蛋白表达增强,并阻止Mcl-1在细胞内的降解,增加Mcl-1蛋白在细胞内的稳定性和抗凋亡作用。其机制是通过激活MAPK/ERK1/2信号通道,使ERK磷酸化并向细胞核内转运,激活靶蛋白Mcl-1产生抗凋亡作用。GCDA还能促进Mcl-1中和促凋亡蛋白Bim、Bak的作用使其失活,并减少Bim和Bak的相互结合,阻止细胞色素C的释放,抑制细胞凋亡。5.GCDA作用下存在DNA的损伤与修复,为下一步研究打下了基础。