自然流产是常见的病理妊娠,其发生率在国内外均较高。国内的发生率可达全部妊娠的10～15%,且其中80%以上的自然流产发生在孕早期(孕12周以内)。诱发自然流产的原因复杂,涉及遗传、免疫、内分泌、生殖道解剖异常、感染、创伤,甚至环境等其他未知因素。在目前的检查和医疗技术条件下,仍有高达60～70%的自然流产者无法找到确切的病因。经传统的细胞遗传学观察(核型分析),在<15孕周的自然流产中,约有一半以上的自然流产胚胎存在染色体异常。本实验室的研究结果表明,染色体异常占早期自然流产的53.3%(88/165),但其中46.7%(77/165)的核型正常者找不到明确的病因。因此,有必要就自然流产的病因及其发病机制进行进一步的探索。表观遗传学是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下,基因的功能发生了可遗传变化的一门遗传学分支学科。DNA甲基化是表观遗传信息的最主要形式,哺乳动物基因组DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNAmethyltransferase, Dnmt)的催化下,以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)为甲基供体,将甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的5位碳原子上生成5-甲基胞嘧啶(5-dmC)的过程。不仅5-甲基胞嘧啶的多少可直接反应DNA的甲基化程度,而且正常的DNA甲基化模式对哺乳动物的生长发育也至关重要。其通过基因印迹、基因沉默和女性X染色体失活等作用在胚胎发育早期建立的特异性甲基化模式,可在胚胎发育和增殖过程中稳定传递,并影响着个体整个的生长和发育过程。所以,理论上推测,DNA甲基化的异常有可能与自然流产存在着某种相关性。然而,对DNA甲基化水平的研究现多集中于各种肿瘤上,如胃癌、结肠癌等。关于DNA甲基化水平与自然流产关系的研究报道迄今为止仅有2篇。一篇是1983年Cezar等为了弄清整个基因组甲基化水平和克隆胚胎发育能力之间的关系,对9例自然流产克隆牛胎儿、7例成活的克隆牛胎儿以及11例健康成年克隆牛的整个基因组甲基化水平的研究。另一篇是Li-Jun Y等人在2012年为分析自然流产中的DNA甲基化水平的作用,分别对16例自然流产绒毛和16例人工流产绒毛DNA甲基化水平及其Dnmtl、 Dnmt3a的表达所做的测定比较。结果都显示DNA甲基化水平可能与自然流产有关。但由于相关的研究报道数量极为有限,且样本量过少,因此,DNA甲基化水平与不明原因早期自然流产之间的关系时至今日尚无明确定论。DNA甲基化水平受DNA甲基转移酶活性降低、组蛋白甲基化异常、RNA干扰以及饮食环境因素等方面的影响,并与个体的年龄相关。DNA甲基化必须在DNA甲基转移酶的催化下才能完成,因此,DNA甲基转移酶酶对DNA甲基化作用至关重要。目前已发现有甲基转移酶活性的DNA甲基转移酶有Dnmtl、 Dnmt3a和Dnmt3b。其中Dnmtl是哺乳动物最主要的DNA甲基转移酶,表达于复制状态的增殖细胞,能够优先催化复制后半甲基化的DNA双链,使低甲基化的子链完全甲基化,确保每个细胞的DNA甲基化模式的正常复制,在甲基化的维持中具有重要作用。Dnmt3a和Dnmt3b是重新甲基化的DNA甲基转移酶,其主要功能是特异性地作用于未甲基化的DNA双链,在配子形成期和胚胎早期重新建立甲基化模式,且两者在催化功能上相互补充,Dnmt3a可优先使核小体之外裸露部分的DNA甲基化,而Dnmt3b则可使核心区DNA甲基化。目前,国内外关于DNA甲基转移酶与甲基化水平的相关性的报告很多,但结果却不尽相同。Li-Jun Y、 Liu Q、 Robert和Suzuki的研究结果表明,Dnmtl在DNA甲基化过程发挥着主导作用；Rheel和Leu的结果表明,在DNA甲基化过程中,Dnmtl和Dnmt3b是联合起作用的；而Ting的两次实验结果则表明,不同细胞对Dnmtl的依赖性不同,即Dnmtl在某些细胞甲基化过程中并不起主导作用。另外,关于DNA甲基转移酶对自然流产中DNA甲基化作用的研究论文只有一篇,即Li-Jun Y等在2012年对自然流产绒毛DNA甲基化水平与Dnmtl、 Dnmt3a蛋白表达关系的研究。结果显示：与人工流产绒毛相比,自然流产绒毛中存在DNA甲基化水平降低的现象,同时Dnmtl蛋白表达不足,提示Dnmtl不足和自然流产绒毛组织中DNA甲基化水平的降低可能存在相关性。由于相关研究报道数量太少,所以,DNA甲基转移酶在自然流产绒毛中DNA甲基化的促进和维持过程中到底发挥着什么样的作用,他们之间的关系究竟为何?这些问题仍有待于进一步的实验研究来回答。基于以上分析,本研究旨在于探讨DNA甲基化水平与不明原因早期自然流产的相关性,以及DNA甲基转移酶Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b在早期自然流产绒毛DNA甲基化的促进和维持中的作用。本实验分为以下三部分：第一部分：高效液相法检测基因组DNA甲基化水平方法的建立。采用的色谱条件：Agilent1100高效液相色谱仪(Agilnt G1311A泵、Agilnt G1316A紫外检测器、AgilntG1313A自动进样器),Thermo C18柱(6mm×250mm,5μm),0.1%甲酸溶液-甲醇(体积比99：1)为流动相；流速1ml/min,进样量20μl,紫外检测波长280nim,柱温30℃。(1)紫外吸收波长的优化。用两标准品混合液在240-300nm之间进行波长扫瞄,选择最佳的紫外吸收波长。(2)标准方程的建立。配制的5管不同浓度梯度的标准品混合溶液,其中脱氧胞苷(dc)的浓度分别为1、5、10、50、10Oμmol/L;5-甲基脱氧胞苷(5-dmc)的浓度分别为0.05、0.25、0.5、2.5、5μmol/L.分别进样,利用峰面积对相应的物质量浓度(μmol/L)绘制dC和5-dmC的标准方程。(3)精密度实验。使用5号管两标准品混合液连续进样5次,利用峰面积和保留时间计算标准差及相对标准偏差(RSD),以反映仪器的精密度。(4)稳定性实验。每小时进样一次5号管两标准品混合液,连续5次,利用峰面积和保留时间计算标准差及RSD,以反映样品和仪器的稳定性。(5)专属性实验。用纯水分别代替酶解后样品和DNA溶液作为空白对照和阴性对照,将标准品、待测样品、空白对照品和阴性对照品逐个进样,比较峰形和保留时间以判断该方法对检测dc和5-dmmc的专属性。第二部分：基因组DNA甲基化水平与不明原因早期自然流产相关性的研究。本部分实验分为自然流产母亲组、自然流产绒毛组、人工流产母亲组和人工流产绒毛组。采用第一部分建立的高效液相色谱法测得每个样品dC和5-dmC的峰面积,以求得每组5-dmC/(dC+5-dmC)平均比值,并以此代表总体DNA甲基化水平。DNA甲基化水平(%)=5-dmC/(5-dmC+dC)×100%第三部分：从mRNA表达量上研究Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b在早期自然流产绒毛基因组DNA甲基化中的作用。本部分实验分为自然流产绒毛组和人工流产绒毛组。运用实时荧光定量聚合酶链反应法((RT-PCR)分别比较各组绒毛组织中Dnmt1、 Dnmt3a和Dnmt3b的mRNA表达。结果第一部分：高效液相法检测基因组DNA甲基化水平的建立(1)紫外吸收波长的确定dc和5-dmmc两标准品混合液在240-300nim之间进行波长扫瞄的结果显示：dC在280-295nm间的吸光度相差不大,5-dmC在280nm处有最大吸收,最后选用280nim为紫外吸收波长。(2)标准方程的建立利用峰面积相对应的物质量浓度绘制dC和5-dmC的标准方程。dc的标准方程为：=0.17X+0.0004,r=0.999：5-dmC的标准方程为Y=0.18X+1.711,r=1。说明它们的摩尔浓度和峰面积之间呈良好的线性关系。(3)精密度实验dC的保留时间为5.98±0.09,RSD=1.5%；峰面积为5540.3±59.13,RSD=1.1%。5-dmC的保留时间为11.38±0.17,RSD=1.5%；峰面积为259.2±3.38,RSD=1.3%。表明仪器的精密度良好。(4)稳定性实验dC的保留时间为5.94±0.83,RSD=1.3%：峰面积为5536.1±61.43,RSD=1.1%；5-dmC的保留时间为11.45±0.11,RSD=0.9%;峰面积为258.06±2.33,RSD=0.9%。表明样品和仪器的稳定性良好。(5)专属性实验空白对照、阴性对照和待测样品与标准品的峰型相比较,空白对照和阴性对照的图谱中均无目标峰型出现；检测待测样品时,色谱图中虽然出现了目标峰和其他杂峰,但杂峰对目标峰没有造成干扰。表明专属性良好。第二部分：基因组DNA甲基化水平与早期自然流产相关性的研究(1)自然流产母亲组和人工流产母亲组年龄的比较34个自然流产妇女年龄为21-43岁,平均30.85±5.28(岁)；33例人工流产妇女年龄为23～48(岁),平均29.52±4.95(岁)。两组年龄差异无统计学意义(P<0.289)。(2)自然流产母亲组和人工流产母亲组基因组DNA甲基化水平的比较34例自然流产母亲组DNA甲基化水平为4.41±0.65；33例人工流产母亲组DNA甲基化水平4.15±0.63。两组间DNA甲基化水平差异无统计学意义(P=0.103)。(3)自然流产绒毛组和人工流产绒毛组基因组DNA甲基化水平的比较45例自然流产绒毛组DNA甲基化水平为2.29±0.37；44例人工流产绒毛组DNA甲基化水平为4.56±1.02。两组间DNA甲基化水平差异有统计学意义(P=0.000)。第三部分：从mRNA表达量上研究Dnmtl、 Dnmt3a和Dnmt3b在自然流产绒毛基因组DNA甲基化中的作用(1)自然流产绒毛组与人工流产绒毛组Dnmtl mRNA表达量的比较30例自然流产绒毛组织Dnmtl mRNA的相对表达量为0.033±0.007；33例人工流产绒毛组织Dnmtl mRNA的相对表达量为0.071±0.017。两组间Dnmtl mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P=0.000)。(2)自然流产绒毛组与人工流产绒毛组Dnmt3a mRNA表达量的比较30例自然流产绒毛组织Dnmt3a mlhNA的相对表达量为0.072±0.013；33例流产人工绒毛组织Dnmt3a mRNA的相对表达量为0.184±0.049。两组间Dnmt3a mRNA的相对表达量差异有统计学意义(P=0.000)。(3)自然流产绒毛组与人工流产绒毛组Dnmt3b mRNA表达量的比较30例自然流产绒毛组织Dnmt3b mRNA的相对表达量为0.008±0.003；33例人工自然流产绒毛组织Dnmt3b mRNA的相对表达量为0.005±0.001。两组间Dnmt3b mRNA的相对表达量差异无统计学意义(P=0.071)。根据上述实验结果,本研究可得出以下初步结论：(1)本实验建立的高效液相色谱法能够准确灵敏地检测全基因组DNA甲基化水平,仪器精密度及稳定性良好,该方法对检测dc和5-dmc专属性强；(2)自然流产绒毛中确实存在着基因组DNA甲基化水平降低的现象,绒毛基因组DNA甲基化水平降低很可能是自然流产的一种独立诱发因素；(3)自然流产绒毛组织中基因组DNA甲基化水平降低的现象可能是由Dnmt1和Dnmt3a共同作用的结果；Dnmt3b可能在自然流产绒毛组织中基因组DNA甲基化水平降低中不起主要作用。