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慢性乙型肝炎是全球尤其是我国感染人群众多的一类病毒性传染病，临床尚无根治药物，且现有药物存在疗程长、剂量大、疗效低、易产生耐药、停药后复发等问题，针对乙肝病毒生命周期的新靶点基因药物成为研究热点。其中，基因药物10-23DNAzyme，特异性抑制乙肝病毒抗原表达的能力强，但存在分子量大、药物递送难等问题。本文设计合成特异性抑制乙肝病毒C基因(表达HBeAg)和S基因(表达HBsAg)复制的10-23DNAzyme(DrzBC和DrzBS)作为治疗基因，制备合成三种功能性糖脂嫁接物:壳寡糖硬脂酸嫁接物(Chitosan oligosaccharide-g-stearic acid，CSSA)、壳寡糖硬脂胺二硫键嫁接物(Chitosan oligosaccharide-ss-octadecylamine，CSSO)、半乳糖化壳寡糖硬脂胺二硫键嫁接物(Galactosylated chitosan oligosaccharide-ss-octadecylamine，Gal-CSSO)，分别作为胶束载体静电复合构建基因递释系统，用于抗乙肝病毒治疗研究。
为实现治疗基因DrzBC和DrzBS的肝细胞胞浆有效递释，构建CSSA基因递释系统。采用酶解法制备得到低分子量壳聚糖(壳寡糖)，碳二亚胺法化学嫁接硬脂酸的羧基与壳寡糖活性氨基，合成CSSA。CSSA粒径为67.3±3.4nm，氨基取代度为37.9±0.62％，临界胶束浓度为75.02±1.27μg/mL。经凝胶阻滞电泳分析，优选N/P=10构建基因递释系统CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS。以HBV病毒转染HepG2.2.15为模型细胞，与基因递释系统共孵育。CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS对抗原表达的抑制率，72h内随时间延长而提高，72h达到最大抑制率，分别为82.51±1.28％和84.11±2.62％，72h后抑制率略有下降。脂质体基因递释系统Lipo2000/DrzBC和Lipo2000/DrzBS对HBeAg和HBsAg表达的抑制率，48h内随时间延长而提高，48h达到最大抑制率分别为47.29±1.86％和33.58±0.72％，48h后抑制率下降。与阳性对照Lipo2000基因递释系统相比，共孵育相同时间，CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS对HBeAg和HBsAg表达的抑制率均明显提高，且最大抑制率峰值分别提高了0.74倍和1.50倍。经细胞摄取实验发现，高氨基取代的CSSA可被细胞快速摄取并浓集于胞浆，有利于作用靶区在细胞浆的10-23DNAzyme发挥药效。CSSA和Lipo2000与细胞共孵育48h的IC50值分别为412.5μg/mL和6.8μg/mL，CSSA的细胞毒性明显低于Lipo2000，安全性良好。
为加快基因递释系统的药物释放，首次设计针对肝细胞高浓度GSH敏感释放的CSSO基因递释系统。采用两步酰胺反应法，以3，3-二硫代二丙酸分别交联壳寡糖和硬脂胺，合成CSSO。CSSO粒径为123.00±10.98nm，氨基取代度为6.79±0.15％，临界胶束浓度为65.84±1.11μg/mL。经凝胶阻滞电泳分析，优选载体/药物投料比为60，构建基因递释系统CSSO/DrzBC和CSSO/DrzBS。CSSO/DrzBC和CSSO/DrzBS对HepG2.2.15表达HBeAg和HBsAg的抑制率，48h为73.86±1.77％和67.80±2.51％,72h继续上升至83.83±2.34％和76.79±2.18％，抑制率明显高于Lipo2000基因递释系统，且最大抑制率峰值分别提高了0.77倍和1.29倍。与CSSA系统相比，CSSO系统的24h药效显著提高，显示CSSO系统具有快速起效特点。采用荧光标记和共聚焦显微镜观察，发现CSSO基因递释系统从溶酶体快速逃逸，随后响应肝细胞内高GSH快速释放基因。CSSO胶束及其基因递释系统与细胞共孵育48h，细胞存活率＞80％，安全性优于CSSA。
基于HBV主要感染宿主为肝实质细胞，提高基因递释系统的肝实质靶向性，有利于实现体内的基因有效治疗。利用肝实质细胞特有去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)可专一性识别半乳糖基的特性，选择半乳糖基作为肝实质细胞主动靶向配体，采用碳二亚胺法链接CSSO的氨基与乳糖酸的半乳糖基，合成半乳糖化CSSO(Gal-CSSO)。Gal-CSSO粒径为138.33±3.68nm，氨基取代度为11.91±0.21％，临界胶束浓度为81.06±1.32μg/mL。选择载体/药物投料比为60，构建基因递释系统Gal-CSSO/DrzBC和Gal-CSSO/DrzBS。Gal-CSSO/DrzBC和Gal-CSSO/DrzBS对HepG2.2.15表达HBeAg和HBsAg的抑制率，48h分别为75.39±1.81％和69.34±1.95％，72h继续上升至85.89±2.57％和79.86±1.87％，抑制率明显高于Lipo2000基因递释系统阳性对照，且最大抑制率峰值分别提高了0.82倍和1.38倍。通过荧光标记和共聚焦显微镜观察，显示Gal-CSSO基因递释系统肝细胞摄取速率、溶酶体逃逸、细胞内基因药物释放等性能，明显强于CSSO系统。HepG2.2.15细胞毒性研究显示，Gal-CSSO胶束及其基因递释系统的细胞存活率均＞80％，毒性低，安全性高。体内分布和肝组织细胞靶向性研究发现，Gal-CSSO基因递释系统的肝组织浓集明显，肝组织内主要由肝实质细胞主动靶向摄取，摄取量是肝组织内Kupffer细胞的7.78倍，显示Gal-CSSO基因递释系统的体内肝脏靶向性和肝实质细胞选择性，明显强于CSSO系统。与空白对照组相似，Gal-CSSO基因递释系统对小鼠体重无影响，给药后体内各组织无明显病变，安全性好，显示其潜在的体内高效安全治疗前景。
为实现治疗基因DrzBC和DrzBS的肝细胞胞浆有效递释，构建CSSA基因递释系统。采用酶解法制备得到低分子量壳聚糖(壳寡糖)，碳二亚胺法化学嫁接硬脂酸的羧基与壳寡糖活性氨基，合成CSSA。CSSA粒径为67.3±3.4nm，氨基取代度为37.9±0.62％，临界胶束浓度为75.02±1.27μg/mL。经凝胶阻滞电泳分析，优选N/P=10构建基因递释系统CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS。以HBV病毒转染HepG2.2.15为模型细胞，与基因递释系统共孵育。CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS对抗原表达的抑制率，72h内随时间延长而提高，72h达到最大抑制率，分别为82.51±1.28％和84.11±2.62％，72h后抑制率略有下降。脂质体基因递释系统Lipo2000/DrzBC和Lipo2000/DrzBS对HBeAg和HBsAg表达的抑制率，48h内随时间延长而提高，48h达到最大抑制率分别为47.29±1.86％和33.58±0.72％，48h后抑制率下降。与阳性对照Lipo2000基因递释系统相比，共孵育相同时间，CSSA/DrzBC和CSSA/DrzBS对HBeAg和HBsAg表达的抑制率均明显提高，且最大抑制率峰值分别提高了0.74倍和1.50倍。经细胞摄取实验发现，高氨基取代的CSSA可被细胞快速摄取并浓集于胞浆，有利于作用靶区在细胞浆的10-23DNAzyme发挥药效。CSSA和Lipo2000与细胞共孵育48h的IC50值分别为412.5μg/mL和6.8μg/mL，CSSA的细胞毒性明显低于Lipo2000，安全性良好。
为加快基因递释系统的药物释放，首次设计针对肝细胞高浓度GSH敏感释放的CSSO基因递释系统。采用两步酰胺反应法，以3，3-二硫代二丙酸分别交联壳寡糖和硬脂胺，合成CSSO。CSSO粒径为123.00±10.98nm，氨基取代度为6.79±0.15％，临界胶束浓度为65.84±1.11μg/mL。经凝胶阻滞电泳分析，优选载体/药物投料比为60，构建基因递释系统CSSO/DrzBC和CSSO/DrzBS。CSSO/DrzBC和CSSO/DrzBS对HepG2.2.15表达HBeAg和HBsAg的抑制率，48h为73.86±1.77％和67.80±2.51％,72h继续上升至83.83±2.34％和76.79±2.18％，抑制率明显高于Lipo2000基因递释系统，且最大抑制率峰值分别提高了0.77倍和1.29倍。与CSSA系统相比，CSSO系统的24h药效显著提高，显示CSSO系统具有快速起效特点。采用荧光标记和共聚焦显微镜观察，发现CSSO基因递释系统从溶酶体快速逃逸，随后响应肝细胞内高GSH快速释放基因。CSSO胶束及其基因递释系统与细胞共孵育48h，细胞存活率＞80％，安全性优于CSSA。
基于HBV主要感染宿主为肝实质细胞，提高基因递释系统的肝实质靶向性，有利于实现体内的基因有效治疗。利用肝实质细胞特有去唾液酸糖蛋白受体(Asialoglycoprotein receptor, ASGPR)可专一性识别半乳糖基的特性，选择半乳糖基作为肝实质细胞主动靶向配体，采用碳二亚胺法链接CSSO的氨基与乳糖酸的半乳糖基，合成半乳糖化CSSO(Gal-CSSO)。Gal-CSSO粒径为138.33±3.68nm，氨基取代度为11.91±0.21％，临界胶束浓度为81.06±1.32μg/mL。选择载体/药物投料比为60，构建基因递释系统Gal-CSSO/DrzBC和Gal-CSSO/DrzBS。Gal-CSSO/DrzBC和Gal-CSSO/DrzBS对HepG2.2.15表达HBeAg和HBsAg的抑制率，48h分别为75.39±1.81％和69.34±1.95％，72h继续上升至85.89±2.57％和79.86±1.87％，抑制率明显高于Lipo2000基因递释系统阳性对照，且最大抑制率峰值分别提高了0.82倍和1.38倍。通过荧光标记和共聚焦显微镜观察，显示Gal-CSSO基因递释系统肝细胞摄取速率、溶酶体逃逸、细胞内基因药物释放等性能，明显强于CSSO系统。HepG2.2.15细胞毒性研究显示，Gal-CSSO胶束及其基因递释系统的细胞存活率均＞80％，毒性低，安全性高。体内分布和肝组织细胞靶向性研究发现，Gal-CSSO基因递释系统的肝组织浓集明显，肝组织内主要由肝实质细胞主动靶向摄取，摄取量是肝组织内Kupffer细胞的7.78倍，显示Gal-CSSO基因递释系统的体内肝脏靶向性和肝实质细胞选择性，明显强于CSSO系统。与空白对照组相似，Gal-CSSO基因递释系统对小鼠体重无影响，给药后体内各组织无明显病变，安全性好，显示其潜在的体内高效安全治疗前景。